[GUIDE] Les techniques de féminisation et de breeding

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Bonjour à tous d'abord je tiens a remercié Exo-Plank pour son travail de recherche,
LeMarcel pour ces conseils, SUB sans qui cela m'aurais pris beaucoup plus de temps je pense
ainsi que tout les autres chez qui j'ai repris la traduction des articles !

Il se peut qu'il restent des mots incompris ou quelques fautes, je n'ai pas tout relu mais ca devrait le faire et dans sa globalité c'est assez compréhensible( surtout pour un scientifique )
Je ne sais pas si il y a un ordre spécifique mais au pire, on me reprendra et j'éditerai merci

1ère fiche:

L'influence des régulateurs de croissance, absorbée par la racine sur l'expression du sexe dans les plantes de chanvre
M.Kh. Chailakhyan et VN Khryanin K

Institut de physiologie végétale Timiriazev, Académie des Sciences de l'URSS, ul Botanicheskaya.35, Moscou, URSS 127273

Résumé.
Application, par le système racinaire, de régulateurs de croissance pour le chanvre (Cannabis sativa L.) ayant ~ 3 paires de feuilles visibles qui ont causé des changements d'expression prononcée sur le sexe chez les individus adultes.
Le traitement par l'acide gibbérellique (25 mg / 1) conduit à que plus de 80% des plantes sont des mâles, c'est à dire qu'ayant des fleurs mâles (contrôles, ca. 30%). Le traitement par la 6-benzylaminopurine et avec de l'acide indole-3-acétique (cas ineither, 15 mg / 1) a entraîné dans toutes les usines étant eitherfemale (fleurs femelles) ou intersexués (fleurs bisexuées); traitement à l'acide abscissique (10 mg / 1) avait un effet semblable mais un peu moins prononcé.

Mots clés: acide abscissique - auxine - Cannabis-Cytokinin - Fleurs (sexe) - expression Sex - gibbérelline

Fig 1. L'influence des régulateurs de croissance, absorbée par les racines sur la croissance et le sexe expréssion de chanvre plantes, fromleft à droite : contrôles, acide gibberiliques, 6-Benzylaminopurine, indole-3-acides acétiques, acid abscisique (ABA)
Table 1.Effet de pousser les organismes de réglementation, absorbée par les racines, sur la croissance et le sexe expression de chanvre plantes


Il est bien connu que l'expression du sexe chez les plantes à fleurs unisexuées peuvent être modifiées par un traitement hormonal. Dans le chanvre (Cannabis sativa L.), la pulvérisation de solutions gibbérelline augmente le nombre de plantes mâles, les plantes à-dire avec des fleurs staminées (Atal, 1959; Zhukov et al, 1963;. Chailakhyan et al, 1969;. Khryanin, 1969) lors de la pulvérisation avec de l'auxine favorise l'apparition de plantes femelles (fleurs femelles) et «intersexes» (fleurs bisexuées ou hermaphrodites) (Heslop-Harrison et Heslop-Harrison, 1956). traitement Cytokinin promu la formation des fleurs femelles dans une vigne de sexe masculin (Negi et Olmo, 1966).

Sex expression dans le chanvre a été trouvé à déterminer très tôt, quand la troisième paire de feuilles est devenue visible (Khryanin et Milyaeva, 1977). Nous avons étudié l'effet des régulateurs de croissance, appliquée aux racines de plantes de chanvre de cet âge (2-3 paires de feuilles), sur l'expression sexuelle ultérieure.

Graines de chanvre, la souche US-6, obtenu à partir de l'Institut de plantes à fibres, Glukhov, URSS, ont germé pendant
3 jours dans le noir sur du papier filtre imbibé d'eau, à 25 ~ C. Les plantules sélectionnées pour les racines d'égale longueur ont ensuite été placés avec leurs racines dans 1- 3-1 ou récipients avec de l'eau pendant 2 jours, et après ce pendant 24 h dans des solutions de régulateurs de croissance.
Les traitements, avec 70 plants de chaques, ont été: 1) témoin (eau); 2) 25 mg / 1 d'acide gibbérellique (GA3); 3) 15 mg / 1 6-benzylaminopurine (BAP); 4) 15 rag / 1 indole- l'acide 3-acétique (IAA) et 5) 10 mg / 1 d'acide abscissique (ABA). Après traitement, les plantes ont d'abord été placées dans une solution nutritive 1/10-strength Knop, et après 2 d transféré à demi-force Knop et après 2 j à Knop à pleine puissance. La solution nutritive a été aéré tous les jours.
Avant, pendant et après le traitement des plantes ont été conservés dans la serre, sur les 8-h les jours courts, jusqu'à ce que l'expression du sexe a été clairement.

Une vue d'ensemble des plantes près de la fin de l'expérience est représenté sur la figure 1. Les résultats sont résumés dans le tableau 1. Aux concentrations utilisées GA 3 ont favorisé la croissance des pousses tout en BAP a inhibé; dans la croissance d'autres traitements ne diffère pas de celle des témoins.

Les feuilles des plantes BAP-traitées sont vert foncé, celles de ceux traités par GA3 vert jaunâtre. Après 15 jours de croissance, gonflement est apparu dans les racines des plantes BAP-traités, un examen microscopique a montré qu'ils ont été causés par la prolifération des cellules du parenchyme de la racine.

Les plantes traitées avec GA3 boutons floraux formés 4 dearlier que les témoins alors que le traitement de l'AAI a retardé l'apparition des boutons floraux; dans les autres traitements, les bourgeons floraux sont apparues au moment même que chez les témoins. Dans toutes les usines, les boutons floraux est apparu lorsque les plantes ont trois paires de feuilles visibles, sauf dans le traitement BAP où ils sont apparus après la formation de deux de ces paires de feuilles.

Quant à l'expression du sexe, de traitement GA3 abouti à la formation de plus de 80% de plants mâles, tandis que chez les témoins, le pourcentage était ca. 30. Dans les deux BAP et les traitements de l'AAI, pas de plantes mâles ont été formés à tous, les plantes deviennent de sexe féminin, ou intersexes, à la place. plantes Représentant du GA3, traitements BAP et de l'AAI sont représentés dans la figure 2. application ABA a également entraîné une réduction du pourcentage de plantes mâles, mais l'effet, aux concentrations utilisées, a été plus faible que celle des deux BAP ou IAA.

Ainsi, les régulateurs de croissance appliquée par le système racinaire provoquer des changements considérables dans l'expression du sexe des plantes de chanvre, GA 3 induire plantes mate principalement et BAP, l'AAI, et dans une moindre mesure ABA, induisant des plantes femelles et les plantes à fleurs bisexuées. Cet effet des régulateurs de croissance sur l'expression sexuelle se produit tout à fait à un stade précoce de développement des plantes.

Effet des régulateurs de croissance, appliqué son les racines, sur le sexe expression dans le chanvre.
a. effet de GA3 : gauche, 6 contrôle végétal ( 3male,3 femelle); droit 5 végétaux traités (tous les hommes).
b. Effet de BAP: 6 végétaux traités, 3 femelles ceux (à gauche)et 3 intersexes (à droite).
c Effet de l'IAA: 4 végétaux traités, 2 femelles ceux (à gauche) et 2 intersexes (à droite)



Voilà pour cet après midi, ça vous fait déjà de quoi lire un peu, peut ètre une autre dans la soirée

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2ème fiche :

cannabinoïdes végétaux: un trésor négligé pharmacologiques
1 Département de Chimie médicale et les produits naturels, Faculté de médecine, Université hébraïque,
Campus Ein Kerem, Jérusalem 91120, IsraëlCet article a été cité par d'autres articles dans PMC.

Résumé.
La plupart des cannabinoïdes dans le Cannabis sativa L. n'ont pas été pleinement évalués pour leur activité pharmacologique.
Une publication dans ce numéro présente des preuves que des plantes d'un cannabinoïde, Δ 9 -tetrahydrocannabivarin
est un antagoniste puissant de l'anandamide, un cannabinoïde endogène majeur.
Il semble possible que bon nombre des électeurs non-psychotropes de cette usine sera d'intérêt biologique.
Mots-clés: anandamide, antagoniste des récepteurs CB1, antagoniste du récepteur CB2,
vas deferens de souris, Δ 9 -tétrahydrocannabinol, Δ 9 -tetrahydrocannabivarin, -(+)-( R ) - WIN55212

Cannabis sativa L. produit plus de 60 terpeno-phénols qui n'ont pas été détecté dans aucune autre plante.
Un de ces constituants, Δ 9 -tétrahydrocannabinol (THC) (Gaoni & Mechoulam, 1964 )
a été l'objet de milliers de publications, comme il est de loin le principe psychoactif majeur dans la marijuana et du haschisch.
Le cannabidiol (CBD), une composante nonpsychoactive, a également été largement étudiée en raison de son anti-inflammatoire,
anti-épileptiques et propriétés antischizophrenic (Pertwee, 2005 ). Étonnamment, les cannabinoïdes végétaux ont été la plupart du temps négligé.
acides de cannabinoïdes, qui sont des précurseurs des cannabinoïdes neutre, comme le THC et CBD, se sont avérés être des antibiotiques
et ont effectivement été utilisés pendant un certain temps en médecine vétérinaire en Tchécoslovaquie ya environ 50 ans.
La plupart des cannabinoïdes autres plantes ont été testées pour psychoactivité possible. Lorsque aucun n'a été trouvé, l'intérêt pour eux diminué ( Figure 1 ).

Figure 1
Structures de certains cannabinoïdes mentionnés ci-dessus.

La découverte du système endocannabinoïde et la pléthore d'activités de la endocannabinoïdes soulèvent la possibilité
que certains des cannabinoïdes végétaux peut entraîner des effets connexes. Le plus connu endocannabinoïdes mieux,
l'anandamide et-arachidonoyl glycérol 2, ont été trouvés à jouer un rôle non seulement dans le système nerveux central,
mais aussi dans la plupart des systèmes physiologiques qui ont été étudiés -le système immunitaire, le système cardiovasculaire,
la reproduction, les voies respiratoires, des systèmes squelettique, pour n'en nommer que quelques-uns.

Certaines des activités sont CB1/CB2 dépendant du récepteur cannabinoïde, mais beaucoup le sont pas.
De nombreux récepteurs supplémentaires ont été proposées ( Howlett et al ., 2002 ).
Est-il possible que certains des cannabinoïdes végétaux, qui ne sont pas psychoactives
(et probablement ne pas se lier au récepteur CB1), sont également actives dans ces systèmes?

Récemment, il a été d'un intérêt renouvelé dans les cannabinoïdes végétaux négligés.Ce n'est certainement pas une renaissance pour le moment.
Lors d'une réunion de la Cannabinoid Research Society International, Maor et al . (2005)
a signalé que le diméthylheptyl homologue nonpsychoactive de cannabigerol (CBG-DMH)
a vasorelaxant et propriétés hypotensives.

Vasorelaxation de l'aorte abdominale chez le rat par la CBG-DMH a été sensible à la toxine pertussis
et n'est pas inhibée par un inhibiteur de la NO synthase ou par CB1/CB2 ou antagonistes des récepteurs vanilloïdes.
CBG-DMH supprime également la production d'oxyde nitrique et la formation de facteur de nécrose tumorale
α par les macrophages murins.Le mécanisme de l'effet hypotenseur est assez obscure.
Elle peut être liée à celle provoquée par une anomalie, le cannabidiol, un isomère de la CDB ( Ho & Hiley, 2003 ),
qui a été signalé il ya plusieurs décennies, comme l'effet de ces deux composés est inhibée par la CDB.

Fait intéressant, la CDB n'inhibe pas l'hypotension provoquée par le THC.
Est-DMH GBC, une usine de dérivés cannabinoïdes hypotension cause, par l'intermédiaire d'un nouveau mécanisme?
Dans ce numéro du British Journal of Pharmacolog, Thomas et al.(2005) montrent que
l'autre particule des cannabinoïdes végétaux négligés, tetrahydrocannabivarin (THCV), l'homologue de propyle de THC ( Gill et al ., 1970 ),
est un antagoniste puissant des WIN55212 (WIN) et de l'anandamide. il présente au moins un certain degré de sélectivité
car il est plus puissant pour neutraliser ces agonistes dans le canal déférent que dans les membranes du cerveau.*

Il est également plus puissante pour neutraliser l'inhibition par WIN et l'anandamide des contractions évoquées électriquement du canal déférent
( K B des valeurs de 1,5 et 1,2 n M, respectivement) que dans les contrarier l'inhibition provoquée par le THC ( K B valeur de 97 n M ).
THCV déplacées [ 3 H] CP55940 (un cannabinoïde agoniste de synthèse) à partir de CB1 spécifiques des sites de liaison
sur le cerveau de souris et de cellules CHO hCB2 membranes avec une moyenne K i de 75,4 et 62,8 n M , respectivement.
A 3000-1000 n M , THCV n'a pas inhibé les contractions évoquées électriquement isolées du canal déférent de souris,
mais les concentrations de THCV dans cette gamme de produits changements dextre dans les courbes concentration-réponse
journal de WIN et anandamide pour contractions évoquées électriquement.

Ces changements n'ont pas été accompagnées par une diminution de l'effet maximal de chaque agoniste.
Cependant, à des concentrations supérieures à 3 μ M , THCV a réduit la réponse contractile du canal déférent
dans un antagoniste des récepteurs CB1 (SR141716) indépendante manière-. Ainsi, THCV ressemble à cet antagoniste,
qui, à haute (micromolaire) doses interagit également avec des objectifs non-CB1. THCV (100 n M )
ne s'oppose pas à l'inhibition de contractions évoquées électriquement provoquée par la clonidine ou la capsaïcine.
Ni THCV ni WIN (à la fois à 1 μ M ) a modifié la taille des contractions induites par β , γ -méthylène-ATP ou de la phényléphrine.
Sur cette base, les auteurs concluent que THCV interagit avec WIN sur les sites préjonctionnel.

La découverte de l'antagoniste du récepteur CB1/CB2 aptitude à la compétition de THCV pose de nombreux,
encore sans réponse, des questions. Dans l'édition originale sur THCV, Gill et al . (1970) a indiqué qu'il est environ
cinq fois moins actif que le THC en produisant un effet cataleptique chez la souris et l'évolution dans le temps de son
action semble différent.

Est-ce l'effet CB1 médiation? Est-THCV de la marijuana, en particulier dans le haschisch pakistanaise,
où, apparemment, il se trouve dans des concentrations plus élevées que dans la marijuana utilisée en Europe et aux États-Unis,
la baisse ou à améliorer (ou modifier) une action du THC? Est-THCV imiter les autres de nombreuses activités avec SR141716 vu?
En supposant que sa toxicité est faible, comme il est indiqué pour la plupart des cannabinoïdes, peut-il servir comme un médicament de
l'obésité ou de dépendance à la nicotine que le rimonabant (nom générique pour SR141716)?

A propos il ya 30 ans, Paton et Pertwee (1973) a commenté sur le cannabis:
«Nor-t-on facilement trouver une autre substance afin« contradictoire », capable d'apprivoiser encore la production de l'agressivité,
à la fois renforcer et en appuyant sur l'activité spontanée, d'être encore générer des anticonvulsivants épileptiformes corticale rejets.

Est-ce «contradictoire» du comportement en raison, en partie du moins, à la présence de «contradictoire» des composants tels
que THCV avec un antagoniste des propriétés agonistes? Un tel comportement par les cannabinoïdes n'est pas inattendu.
Fride et al . (1995) a constaté que des doses faibles et même de l'anandamide (de 0,0001 à 0,1 mg / kg), qui n'a eu aucun effet lorsqu'il est administré seul,
partiellement ou totalement inhibée THC effets induits.

Et, Bayewitch et al.(1996) a rapporté que le THC antagonise l'inhibition induite par un agoniste de l'adénylcyclase médiée par le récepteur CB2
et a conclu que le THC constitue un antagoniste faible pour ce récepteur dans les conditions de leurs analyses.
Un profil biphasique de l'action a été noté pour les cannabinoïdes nombreuses (voir, par exemple, Sulcova et al ., 1998 ).

Bon nombre des effets observés avec l'anandamide, WIN et le THC ne sont pas CB1-dépendant ( Howlett et al ., 2002 ).
Comme la plupart des cannabinoïdes végétaux ne sont pas lier à ce récepteur, il semble raisonnable d'évaluer ces composés
pour leurs activités dans un large éventail de tests. Je crois sincèrement que les cannabinoïdes végétaux sont un trésor
pharmacologiques négligées.

Références:
• M. BAYEWITCH, RHEE M.-H., Avidor-REISS T., BREUER A., R. Mechoulam, VOGEL Z. Δ 9 -tétrahydrocannabinol antagonise les périphériques inhibition médiée par le récepteur cannabinoïde de l'adénylcyclase. J. Biol. Chem. 1996; 271 -9905. :9902 [ PubMed ]
• FRIDE E., J. BARG, LEVI R., SAYA D., R. Heldman, Mechoulam R., VOGEL Z. De faibles doses de anandamides inhiber les effets pharmacologiques du Δ 9 -tétrahydrocannabinol. J. Pharmacol.Exp. Il. 1995; 272 -707. :699 [ PubMed ]
• Gaoni Y., Mechoulam R. Isolement, structure et la synthèse partielle d'un constituant actif du haschisch. J. Am. Chem. Soc. 1964; 86 :1646-1647.
• GILL EW, PATON WDM, Pertwee RG expériences préliminaires sur la chimie et la pharmacologie du cannabis. Nature. 1970; 228 -136. :134 [ PubMed ]
• HO, Hiley CR actions vasodilatatrices du cannabidiol anormal chez le rat isolés petite artère mésentérique. Br. J. Pharmacol. 2003; 138 -1332. :1320 [ PMC gratuitement l'article ] [ PubMed ]
• AC Howlett, BARTH F., Bonner TI, CABRAL G., CASELLAS P., Devane WA, Felder CC, Herkenham M., K. MACKIE, MARTIN BR, Mechoulam R., Pertwee RG Union internationale de pharmacologie.XXVII. Classification des récepteurs des cannabinoïdes. Pharmacol. Rev 2002; 54 -202. :161[ PubMed ]
• MAOR Y., M. HOROWITZ, GALLILY R., R. Mechoulam cannabigérol-diméthyl heptyl (CBG-DMH), un cannabinoïde synthétique avec des propriétés hypotensives et vasorelaxant Symposium 2005 sur les cannabinoïdes 2005. 152Burlington, Vermont, Cannabinoid Research Society International, p.
• PATON WDM, Pertwee RG La pharmacologie du cannabis chez les animaux de la marijuana, chimie, pharmacologie, métabolisme et les effets cliniques 1973. New York: Academic Press Inc; 191-285.ed. Mechoulam, R. p.
• Pertwee RG cannabidiol comme un médicament potentiel cannabinoïdes comme Therapeutics2005. Bâle: Birkhauser Verlag; 47-65.ed. Mechoulam, R. p.
• Sulcova E., R. Mechoulam, FRIDE E. effets biphasiques de l'anandamide. Pharmacol. Biochem.Behav. 1998; 59 -353. :347 [ PubMed ]
• THOMAS A., STEVENSON LA, WEASE KN, PRIX MR, BAILLIE G., ROSS RA, Pertwee RG preuve que l'usine de cannabinoïdes Δ 9 -tetrahydrocannabivarin est un cannabinoïde CB1 et CB2 antagoniste des récepteurs de Br. J. Pharmacol 2,005. 146 917-926.

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pas de quoi

3ème fiche:

UNE ANALYSE DE LA VARIATION chimiotaxonomiques cannabinoïdes dans CANNABIS

KARL W. Hillig 2 ET PAUL G. Mahlberg

Indiana Département de biologie, Université de l'Indiana, Bloomington, Etats-Unis 47405

1 Manuscrit reçu le 19 Juin 2003; révision a accepté 12 Février 2004.
Les auteurs tiennent à remercier tous ceux qui ont contribué de matériel génétique pour cette enquête. Nous remercions également John McPartland, Mark Bierner, et un relecteur anonyme pour leurs commentaires sur ce manuscrit. Cette recherche a été financée par une subvention de Hortapharm BV, Pays-Bas. Drug Enforcement Administration nombre PI0043113 (PGM).
2 Adresse actuelle: 1010 Saratoga Road, Ballston Lake, NY 12019.

Les cannabinoïdes sont importants marqueurs chimiotaxonomiques unique de cannabis. Des études antérieures montrent que le ratio d'une usine en poids sec de A9-tétrahydrocannabinol (THC) pour le cannabidiol (CBD) peut être attribué à l'un des trois chémotypes et que les allèles BD et alloenzymes coder BT qui catalysent la conversion de cannabigerol à la CDB et le THC, respectivement . Dans la présente étude, les fréquences de la BD et de BT dans les populations échantillon de 157 accessions de cannabis ont été déterminées à partir de motifs de la CDB et de baguage THC, visualisé par électrophorèse sur gel d'amidon. chromatographie en phase gazeuse a été utilisée pour quantifier les niveaux de cannabinoïdes dans 96 des adhésions même. Les données ont été interprétées en ce qui concerne les analyses précédentes de la variation génétique et morphologique de la collection de germoplasme même. Deux biotypes (taxons infraspeci.c de rang non attribuée) de C. sativa et quatre biotypes de C. indica ont été reconnus. Les concentrations moyennes de THC et la fréquence de BT ont été plus élevés dans signi.cantly C. indica que C. sativa. La proportion de haute teneur en THC / CBD chémotype plantes dans la plupart des adhésions attribué à C. sativa est <25% et dans la plupart des adhésions attribué à C. indica était> 25%. Végétaux à des niveaux relativement élevés de tetrahydrocannabivarin (THCV) et / ou cannabidivarin (CBDV) étaient nombreuses seulement dans C. indica. Cette étude prend en charge un concept twospecies de cannabis.

Mots clés: cannabinoïdes; Cannabis; chimiotaxonomie; évolution, la génétique, la taxonomie, tétrahydrocannabinol.

Cannabis (Cannabaceae) a été une source de nombre, de la nourriture, l'huile, la médecine, et enivrante depuis les temps préhistoriques. (Chopra, 1969; Schultes, 1973; Abel, 1980). Que ce soit du genre se compose d'une ou plusieurs espèces est une question d'opinion divisée (Schultes et al, 1974;. Petites et Cronquist, 1976; Emboden, 1981). variétés de cannabis cultivées. nombre et / ou la production de semences (désignée ici comme le chanvre) sont souvent différenciées à partir de souches cultivées à des fins médicinales ou récréatives, mais les relations évolutives entre ces deux groupes et entre cultivées et sauvages ou naturalisées (sauvages) les populations sont pas bien compris. Pour mieux résoudre ces problèmes, une étude systématique de la variation génétique, morphologique, biochimique et a été réalisée sur une collection variée d'adhésions Cannabis 157 cultivées dans un environnement commun (Hillig 2004, sous presse). chimiotaxonomique aspects de cette enquête sont présentés ici. Une analyse qualitative et quantitative de la variation des cannabinoïdes et une méthode de caractérisation des différences entre les populations des cannabinoïdes sur la base d'un modèle génétique simple de fournir de nouvelles preuves concernant l'évolution et la domestication de ce genre socio-économique important.

Les cannabinoïdes sont composés terpénophénoliques unique de cannabis. Elles sont produites par les trichomes glandulaires qui se produisent sur la plupart des surfaces aériennes de la plante (Dayanandan et Kaufman, 1976; Turner et al, 1978.). Environ 61 cannabinoïdes sont connus, bien que certains d'entre eux sont des produits de dégradation ou d'artefacts (Schultes et Hofmann, 1980; Turner et al, 1980.). Les cannabinoïdes discutés dans cet article sont biosynthétisées dans un acide (carboxylé) forme et sont décarboxylé par chauffage et de séchage du matériel végétal récoltés (Doorenbos et al., 1971). Ils sont ici visées, dans leur forme décarboxylé. Cannabigérol (GBC) est le précurseur direct de cannabichromene (CBC), le cannabidiol (CBD), et A9-tétrahydrocannabinol (THC) (Taura et al, 1995, 1996;. Morimoto et al, 1997.). Une série homologue de composés avec des chaînes latérales de propyle est synthétisée à partir cannabigerovarin (CBGV), y compris cannabivarichromene (CBCV), cannabidivarin (CBDV), et A9-tetrahydrocannabivarin (THCV), respectivement (Fig. 1A-D) (Schultes et Hofmann, 1980). THC et / ou de la CDB sont généralement produites en plus grande abondance. Toutefois, THCV et, moins fréquemment CBDV peut dépasser les niveaux de THC et / ou de la CDB dans certaines plantes (Baker et al., 1980). THC et THCV sont principalement responsables des effets euphoriques de la marijuana et le haschisch (McPartland et Russo, 2001).

Chimiosystématique a une longue histoire d'utilisation dans la délimitation des taxons cannabis. Lamarck (1785) a souligné le potentiel plus enivrante de C. indica Lam. quand il le différencie de noms C. sativa L. et les descriptions des autres espèces putatives de cannabis ont été publiées (revue dans Schultes et al, 1974;. petites et Cronquist, 1976). Parmi eux, seuls C. ruderalis Janisch. est communément admis. Petit (1979a) a estimé la quantité de THC produite par le cannabis comme une''chromatographie en phase gazeuse extrêmement important''taxonomique des caractères et utilisés (GC) pour différencier des souches à partir de souches sativa indica sur la base de leur teneur en THC (petites et Beck-lieu , 1973a, b; Small et al, 1975;. petites et Cronquist, 1976). Les petites et Cronquist (1976) en faveur d'une notion monospeci.c et attribué ces deux taxons au sous-espèces de C. sativa.
De nombreuses études biochimiques de plants de cannabis cultivés à partir des akènes (graines'''') de l'origine géographique ont été recensés (Fetterman et al, 1971;. Fetterman et Turner, 1972; Nordal et Braenden, 1973; petites et Beckstead, 1973a, b ; Turner et al, 1973;. Turner et Hadley, 1973a, 1974;. Boucher et al, 1974; Holley et al, 1975;.. Petit et al, 1975; Rowan et Fairbairn, 1977; Marderosian Beutler et Der, 1978; Clark et Bohm, 1979; Turner et al, 1979;. Fournier et Paris, 1980;. Hemphill et al, 1980; Veszki et al, 1980;. de Meijer et al, 1992)..études de médecine légale de cannabis ont examiné des échantillons de marijuana et de haschisch d'origine connue, cultivées dans un éventail d'environnements (Jenkins et Patterson, 1973; Poddar et al, 1973;. Baker et al, 1980, 1982;. Barni-Comparini et al, 1984. ;

Fig. 1. Les structures chimiques de divers cannabinoïdes dans un extrait de cannabis.

Brenneisen et ElSohly, 1988). Dans les études où les colonnes garnies pour les séparations chromatographiques en phase gazeuse, la SRC peut parfois avoir été pris pour la CDB en raison de leur temps de rétention proche (petites et Beckstead, 1973a; Turner et Had-ley, 1973b). La plupart des études botaniques et médico-légale des échantillons de cannabis bon manque de identi.cation taxonomiques. Une exception notable est l'étude systématique / médico-légale par les petites et collègues de travail qui est fait abondamment référence dans les présentes (petites et Beckstead, 1973a, b; Small et al, 1975;. Petites et Cronquist, 1976; Petit, 1979a, b).

La teneur en cannabinoïdes de différentes souches de cannabis est associée à leur origine géographique. Extraits de Cannabis indica (chanvre indien'''') étaient couramment utilisés dans la médecine occidentale, tandis que le chanvre commun de l'Europe était généralement considéré comme impropre à l'usage médical (Winek, 1977).Les petites et Beckstead (1973a, b) ont observé que la plupart des souches dans leur collection qui a produit des niveaux élevés de THC est issue d'latitudes sud de 30oN. Ils ont détecté des niveaux élevés d'un cannabinoïde présumé monométhyléther cannabigerol (CBGM) dans les souches de l'Asie du Nord. Des niveaux élevés de THCV ont été signalés dans des souches de cannabis en Afrique australe, l'Inde, le Népal et l'Asie orientale (Merkus, 1971; Fetterman et Turner, 1972;. Turner et al, 1973; Boucher et al, 1974;. Baker et al. 1980).

Les montants de la CDB et de THC dans une usine individuelle cannabis peut être caractérisé à la fois qualitativement et quantitativement (Hemphill et al, 1980;. Hillig, 2002;. Mandolino et al, 2003). caractérisation qualitative consiste à déterminer une plante en THC / CBD rapport (le rapport inverse est parfois utilisé) et de l'assigner à un phénotype chimique distincte (chémotype). Fetterman et al. (1971) a reconnu deux chémotypes: un THC / CBD ratio> 1,0 caractéristique de la drogue''type''plantes, et un THC / CBD ratio <1,0 caractéristique de''ber-type''plantes.. Les petites et Beckstead (1973a, b) a également reconnu une chémotype intermédiaires.Selon leur système de classi.cation (qui est utilisé ici), je chémotype plantes ont une haute teneur en THC / CBD ratio (K1.0), chémotype plantes II ont un rapport intermédiaire (près de 1,0), et chémotype plantes III ont une faible teneur en THC / CBD ratio (K1.0). Le THC / CBD chémotype d'une plante est déterminé à un jeune âge et est stable au-delà du stade plantule pendant toute la durée de la plante (Barni-Comparini et al, 1984;. Vogelmann et al, 1988.).

En plus de la détermination qualitative de THC / CBD chémotype, une plante peut être caractérisée par des niveaux quantitatifs de cannabinoïdes dans ses tissus. Ces taux sont probablement déterminés par l'interaction de plusieurs gènes avec l'environnement d'une usine. De nombreux facteurs biotiques et abiotiques sur la production de cannabinoïdes, y compris le sexe et la maturité de la plante (Doorenbos et al, 1971;.. Fetterman et al, 1971;. Small et al, 1975), la lumière du jour la longueur (. Valle et al, 1978), température ambiante (Bazzaz et al, 1975.), la disponibilité des nutriments (Coffman et Gentner, 1977;. Bo'csa et al, 1997), et intensité de la lumière ultraviolette (Lydon et al, 1987;. Pate, 1994). niveaux quantitative des cannabinoïdes varient également entre les différents tissus dans une usine (Fetterman et al, 1971;. Hemphill et al, 1980.). Le montant de la CDB ou de THC dans le in.orescence maturité d'une usine de pistil (Cannabis est dioïque) peut excéder 10,0% de son poids sec (ps), tandis que le montant de ces cannabinoïdes dans les feuilles primaires est souvent inférieur à 1,0% (Baker et al, 1982;. Barni-Comparini et al, 1984)..

Les petites et Beckstead (1973a, b) et de Meijer et al. (1992) caractérise les populations de cannabis par la détermination de la moyenne de la CDB et la teneur en THC dans un échantillon aléatoire de plantes d'une population donnée et de calculer le THC / CBD (ou CBD / THC) ratio. Cette méthode efface la distinction entre les chémotypes de plantes individuelles. Une autre méthode pour l'analyse de la population est de déterminer la proportion de chémotype I, II, III et les individus au sein d'un échantillon de population et de calculer les fréquences des allèles qui déterminent ce caractère. Cela est possible grâce au contrôle génétique simple de THC / CBD chémotype.

Les enzymes qui catalysent la conversion de la CBG à la CDB et de la CBG au THC ont été isolés (Taura et al., 1995, 1996). De Meijer et al. (2003) l'hypothèse que synthase CBD-acide et synthase THC-acide sont isoformes''''de la même enzyme et sont codés à un seul locus de deux allèles désigné BD et BT, respectivement.Ce modèle d'un seul gène est conforme aux ratios de ségrégation observés pour des croisements contrôlés entre les trois chémotypes (de Meijer et al, 2003;. K. Hillig, données non publiées, l'Université d'Indiana). Dans une population en équilibre de Hardy-Weinberg, les fréquences de la BD et BT devraient être stables d'une génération à la suivante uctuation et non soumis à l'année en année. Des niveaux de cannabinoïdes déclarés par de Meijer et al. (1992).

Hillig (2004), allozymes fréquences des allèles (hors BD et BT) de déterminer que la plupart des 157 accessions de la collection de cannabis en vertu de tirer étude de deux pools de gènes principaux qui correspondent (plus ou moins) pour les circonscriptions de la précédente C. indica et C . sativa. L'allèle le plus commun à chaque locus était le même pour les deux pools de gènes, mais signi.cantly diffèrent par leur fréquence pour 10 des 17 loci étudiés. Toutes les adhésions, mais six ont été attribués aux indicateurs ou pool génétique sativa. Six accessions rudérales de l'Asie centrale ont été provisoirement attribués à un pool génique ruderalis tiers. Les 157 adhésions ont également été affectés à divers taxons en accord avec les précédents traitements taxonomiques et testés pour la bonté de. T aux données génétiques.

TABLEAU 1. circonscription taxonomique de la collection de germoplasme de cannabis sur la base d'une analyse préalable des allozymes fréquences des allèles. L'affectation des adhésions à des taxons putative est issu (Hillig, 2004).





Sur la base de ces résultats, une hypothèse de travail pour une circonscription taxinomique de la collection de germoplasme de cannabis est donnée dans le tableau 1. Cette hypothèse représente une synthèse des traitements polytypique de cannabis par Lamarck (1785), Delile (1849), Janischewsky (1924), Vavilov et Bukinich (1929), Schultes et al. (1974) et Anderson (1980). La reconnaissance de C. sativa et indica C. comme des espèces distinctes est principalement basée sur la fréquence des allèles des allozymes, des différences morphologiques, différentes zones géographiques, et le fait que les populations sauvages présumés des deux espèces ont été trouvées dans la gamme autochtones du cannabis, est présumé être en Asie centrale, le nord-ouest de l'Himalaya, et de l'ouest de la Chine (de Candolle, 1885; Vavilov, 1926; Vavilov et Bukinich, 1929; Zukovskij, 1962; Hillig 2004, sous presse). Putatifs taxons infraspeci.c de rang non affectés sont appelés biotypes''''en attendant une révision taxonomique du genre, en cours. soutien chimiotaxonomique pour une hypothèse de deux espèces est fournie par l'analyse de. variation avonoid qui a détecté C lutéoline-glycuronide dans 30 des 31 usines assignables à C. sativa, mais pas dans 21 des 22 usines assignables à C. indica (Clark et Bohm , 1979).

l'analyse des allozymes a révélé que les adhésions de chanvre dans la collection de germoplasme en vertu de tirer étude à la fois du C. sativa et C. piscines gène indica (Hillig, 2004). variétés de chanvre d'Europe, d'Asie Mineure, et en Asie centrale sont affectés à la biotype de chanvre de C. sativa et les variétés de chanvre Asie méridionale et orientale sont affectés à la biotype de chanvre du C. indica. Adhésions des populations sauvages ou naturalisées en Europe orientale et nord-ouest de l'Himalaya sont affectés à la biotypes sauvages de C. sativa indica et C, respectivement. adhésions rudérale de l'Asie centrale, provisoirement attribuées à C. ruderalis, bien que peu de différences morphologiques ont été observées entre ces adhésions et ceux affectés à la biotype sauvages de C. sativa (Hillig, sous presse). Plantes des accessions cultivées pour la production de drogue ont été caractérisés comme ayant soit étroites lancéolées ou linéaires-lancéolées lea.ets ou large lea.ets oblancéolées.Les deux biotypes découlent de la piscine C. gène indica et sont morphologiquement distinctes (Anderson, 1980; Hillig 2004, sous presse).
L'objectif de la présente étude était de caractériser les modèles qualitatifs et quantitatifs de la variation des cannabinoïdes et les différences dans les BD et les fréquences des allèles entre les taxons BT putatif, dans la même collection de cannabis Hillig (2004, sous presse) ont étudié dans les précédentes études génétiques et morphologiques. Comparaison des modèles génétiques, morphologiques et biochimiques de la variation au sein d'un ensemble unique d'adhésions a été prévu pour faire avancer notre compréhension des relations taxonomiques et évolutives au sein du genre.

MATÉRIELS ET MÉTHODES

collection de matériel génétique-Une collection variée de cannabis adhésions 157 de l'origine géographique connue a été obtenu auprès d'éleveurs, chercheurs, des banques de gènes, et les services répressifs. Chaque adhésion se composait d'un petit paquet de akènes viables. données relatives aux passeports, des codes d'adhésion, et l'attribution des adhésions à des taxons putatifs sont publiés ailleurs (Hillig, 2004). Le chanvre industriel souches sélectionnées pour la production à faible teneur en THC ont été exclus de cette enquête. Les spécimens sont déposés dans l'herbier l'Université d'Indiana (IND). L'affectation a priori des adhésions à des espèces est basée sur une analyse multivariée des allozymes fréquences des allèles et sur l'origine géographique, sans égard à la teneur en cannabinoïdes (Hillig, 2004). Affectation des adhésions à des taxons infraspeci.c (biotypes) est principalement basée sur l'origine géographique, des traits morphologiques, et le but présumé de la culture.

La préparation des échantillons pour l'analyse des plantes de cannabis-GC ont été cultivées dans deux serres sécurisé à l'Université d'Indiana, Bloomington, Indiana, Etats-Unis. Les plants ont été cultivés individuellement dans des pots en argile de 13 cm dans un terreau de trois parties (en volume) de la tourbe noire, deux parties de la vermiculite, et une partie chacun de sable et de terre dessus. Chaque usine a reçu 100 mL de la solution nutritive à intervalles hebdomadaires pendant la période de croissance végétative, composé de 25 M mL de Dyna-Gro 7-9-5 (Dyna-Gro Corporation, San Pablo, Californie, USA) et 18 ml de 1 hydroxyde de potassium (pour neutraliser l'acidité) par 3,8 L d'eau. des plantes femelles ont été isolées à partir de plantes mâles avant la déhiscence des anthères. Le in.orescences des plantes femelles ont été échantillonnés lors de la production de résine de chaque plante a été évaluée visuellement d'avoir atteint son apogée. Les échantillons ont été séchés à l'air à température ambiante et séché à l'étuve pendant une nuit à 30 ° C avant l'extraction. Les feuilles primaires et secondaires plus ont été enlevés, et que visiblement résineux. Bractées orale et de petites feuilles de sous-tendant ont été analysés.

Exemple d'extraction d'exemples matière (50 mg) a été placé dans un tube à essai avec 1 ml de chloroforme. Le matériel végétal a été écrasé avec une baguette de verre et brie.y soniqué pour déloger et / ou de rupture de la résine têtes des trichomes glandulaires. L'échantillon est resté dans le solvant à température ambiante pendant au moins une heure, et a été traité par ultrasons à nouveau pendant quelques secondes. Un volume de 20 fL de l'extrait a été transféré à un petit tube à essai, et on évapore le solvant avec un léger courant d'azote. Le résidu est redissous dans 50 acétone FLOF contenant 0,25 mg / mL de n-eicosane, l'étalon interne.

conditions GC-chromatogrammes ont été générées avec un Hewlett-Packard 5710A chromatographe en phase gazeuse. aménagée avec un de 30 m X 0,53 mm DB-5ms colonne (J & W Scienti.c, Rancho Cordova, Californie, USA) ayant une épaisseur lm. de 1,5 fm. Injecteur et les températures port détecteur ont été 250oC et 300oC, respectivement. taux oe Carrier et de gaz d'appoint. étaient respectivement de 5,8 mL / min (He) et 24,2 mL / min (N2), respectivement. La température est maintenue à 200 ° C pendant 8 min, puis augmenté à 300oCat4oC/min et détenu pendant 4 min. L'intégrateur a été calibré avec des concentrations unique de CBC, de la CDB, la CBG et de THC à 0,5, 0,4, 0,5, et 0,4 mg / mL, respectivement.

Adhésions analysés par GC-Quatre-vingt-six des 157 accessions de cannabis ont été analysés par GC. Les pays d'origine et le nombre d'adhésions de chaque pays sont: l'Afghanistan-10, la Bulgarie-1, de la Chine-6, de la Colombie-2, Gambie-1, Allemagne-1, la Hongrie-8, de l'Inde-5, l'Italie-4, de la Jamaïque -1, Japon-2, le Lesotho-1, le Mexique-4, le Népal-2, Nigeria-1, la Roumanie-2, la Russie-13, l'Afrique du Sud-3, la Corée du Sud-7, l'Espagne-3, le Swaziland-1, de la Thaïlande -6, Turquie-5, de l'Ouganda-2, l'Ukraine-3, et l'ex-Yougoslavie-2. Un à sept usines de chaque adhésion ont été analysés.
Électrophorèse sur gel d'amidon-un résultat fortuit de l'électrophorèse sur gel d'amidon d'une précédente enquête de la variation des allozymes a été que le THC et CBD migré dans les gels d'amidon et ont été colorées par le colorant noir K rapide utilisé pour visualiser les modèles allozymes de baguage de la leucine aminopeptidase (LAP) . Matériel et méthodes pour l'électrophorèse sur gel d'amidon et une photographie montrant des profils de bandes cannabinoïdes sont publiés ailleurs (Hillig, 2004). Environ 10 plantes de chacune des 157 accessions ont été dosés, bien que moins de plantes ont été testées pour obtenir des adhésions à la fin de l'enquête. Par cette méthode, un plus grand nombre de plantes et d'adhésions étaient qualitativement caractérisée que par l'analyse par GC seulement.


Fig2.


TABLEAU 2. Les temps de rétention (RT) et les identités de pointe pour le chromatogramme dans la Fig. 2 d'un extrait de Cannabis indica.



Analyses statistiques analyse statistique a été réalisée avec la version JMP

5.0 (SAS Institute, 2002). THC vs les niveaux de la CDB de plantes individuelles ont été tracées et les lignes de régression distincts ont été calculés pour les trois chémotypes. Moyennes et écarts-type entre le taux de THC / CBD et les limites quantitatives de la CDB et de THC ont été déterminées, ainsi que les corrélations linéaires entre le THC et CBD, pour chacune des trois chémotypes. Moyennes et déviations standards des niveaux quantitatifs de la SRC, la CDB, la CBG, le THC, le THC et CBD + ont été déterminées pour chacun des sept taxons présumés dans le tableau 1, ainsi la somme des surfaces des pics du chromatogramme (par rapport à l'interne standard) correspondant à CBDV et THCV, et pour le pic correspondant à CBGM. test t de Student (P s 0,05) a été utilisée pour déterminer quels moyens ont été signi.cantly différents pour les comparaisons par paires entre les taxons. Moyennes et déviations standards de la fréquence de l'allèle BT ont été déterminées pour chaque taxon putatif. Les proportions estimées de chémotype je individus dans les adhésions et les taxons putatifs ont été déterminées par la quadrature du fréquences correspondant allèle BT.

RÉSULTATS

Un chromatogramme d'une usine de chémotype II d'une adhésion indienne attribués au biotype sauvages de C. indica est représenté sur la Fig. 2. Cette plante a des niveaux relativement élevés de la CDB, CBDV, le THC, et THCV. Le tableau 2 montre les temps de rétention des pics de GC marqué dans la figure. 2.
Qualitative des différences-Un histogramme des rapports de THC / CBD (log10) des plantes individuelles montre trois groupes distincts (Fig. 3). Je Chémotype plantes avaient THC / CBD ratios supérieurs à 50, chémotype plantes II avait THC / CBD ratios entre 0,25 et 1,50, et chémotype plantes III avait THC / CBD ratios moins de 0,20 (tableau 3). THC a été détecté dans les 253 stations étudiées, mais la CDB n'a pas été détecté dans certains chémotype je plantes. La figure 4 montre un diagramme de dispersion des niveaux de THC vs CDB de plantes individuelles, avec des lignes de régression distincts (forcée par l'origine) pour les trois chémotypes. Un très signi.cant (P s 0,0001) existait une corrélation linéaire entre le THC et CBD contenu pour les trois chémotypes, bien que la corrélation pour les plantes III chémotype (r = 0,88) était sensiblement plus élevé que pour chémotypes I et II (r = 0,52 dans les deux cas).

Quantitative des différences-Les concentrations moyennes de THC ont été signi.cantly plus dans la drogue étroite lea.et (NLD) et de grande notice des médicaments (WLD) biotypes de C. indica que dans tous les autres taxons (tableau 4). Le biotype WLD avaient un niveau moyen plus élevé signi.cantly de la CDB + THC que le biotype NLD, tandis que le second avait un niveau moyen inférieur signi.cantly de la CDB. Les biotypes chanvre et sauvages de C. indica moyenne des niveaux plus élevés de THC que la CDB. Adhésions attribué à ruderalis C et le biotype sauvages de C. sativa avait le plus bas des niveaux moyens de la CDB + THC, mais pas signi.cantly inférieur au biotype de chanvre de C. sativa et le chanvre et biotypes sauvages de C. indica.




cannabinoïdes mineurs-Les pics chromatographiques pour la CBC et de la CDB parfois fusionnés en raison de leur temps de rétention proche. Une corrélation très signi.cant (r = 0,79, P s 0,0001) existant entre la SRC et le contenu de la CDB pour les valeurs mises en commun de l'chémotype et II plantes III dans lequel les deux cannabinoïdes ont été détectés, avec environ 6% de ce que Radio-Canada produit que la CDB. La corrélation entre la SRC et le contenu de la CDB pour chémotype je plantes était beaucoup plus faible mais toujours signi.cant (r = 0,25, P = 0,02), alors que la corrélation entre la SRC et la teneur en THC dans ce groupe n'était pas signi.cant (r = 0,19, P> 0,05). Le biotype de chanvre du C. indica avait un niveau supérieur signi.cantly moyenne de Radio-Canada que les autres taxons dans le tableau 4, à l'exception du biotype C. sauvages indica.Le niveau moyen de la CBG a été signi.cantly plus élevé dans le biotype NLD de C. indica que dans les biotypes sauvages de chanvre et de C. sativa.
CBDV, THCV, et CBGM n'étaient pas quanti.ed parce que les normes de calibrage ne sont pas disponibles. Les niveaux apparente (c.-à-aires sous les pics par rapport à l'étalon interne [est]) de ces cannabinoïdes ont été évaluées et comparées (tableau 4).


Vingt-.ve des 29 plantes à la surface des pics de CBGM / est> 0,05 ont été des adhésions de l'Afghanistan, la Chine, le Japon ou la Corée du Sud. Végétaux de deux accessions en provenance de Russie et deux accessions de la Hongrie a également amélioré les niveaux de CBGM.

L'analyse génétique et la CDB et de THC a été retrouvé sous forme de bandes distinctes vers le bas de gels d'amidon colorés avec Fast Black K, avec la CDB migration avant de THC. CDB teinté bleu foncé, violet et le THC teinté foncé. Une bande diffuse dans le bleu qui a eu lieu devant la CDB et de THC était visible pour les plantes avec des niveaux élevés apparente de THCV. Il est probable que ces cannabinoïdes ont migré dans les gels dans leurs formes carboxylés, qui sont solubles dans l'eau. Les profils de bandes cannabinoïdes ont été interprétées en accord avec l'hypothèse selon laquelle un seul gène avec deux allèles codominants contrôle la conversion de la CBG au THC et CBD. Les plantes avec une forte bande CDB ont été attribués le génotype BD / BD, les plantes avec une forte bande de THC ont été attribués le génotype BT / BT, et les plantes avec les deux groupes à peu près égale intensité ont été attribuées le génotype BD / BT.



Vingt-six pour cent des 157 échantillons de population se composait entièrement de génotype des individus BD BD /, et 29% est entièrement composé d'individus génotype BT BT /. Les 45% restants consistaient en une combinaison du génotype BD / BD, BD / BT, et / ou BT / BT individus dans des proportions différentes. Seules les données de BT est indiqué, car la fréquence de BD est complémentaire. La fréquence moyenne de BT varie de 0,04 à C. ruderalis putatifs à 1,00 dans le biotype NLD de C. indica (tableau 5). Il a été signi.cantly plus élevé pour le biotype NLD que pour tous les autres taxons. La fréquence moyenne de BT a également été signi.cantly plus élevé pour les trois autres biotypes de C. indica que pour C. ruderalis putatif et les deux biotypes de C. sativa, qui ne diffèrent pas signi.cantly. Les estimations de la proportion moyenne de chémotype je individus dans les biotypes C. indica variait de 56% dans le biotype sauvages à 100% dans le biotype NLD, tandis que dans C. sativa et C. ruderalis putative la proportion moyenne estimée de chémotype je individus ne pas dépasser 1%. Toutefois, les estimations pour les adhésions individuelles ont varié de 0 à 30% en C. sativa et de 18 à 100% en C. indica (à l'exclusion un Chinois et un Japonais adhésion de chanvre qui peut avoir été délibérément choisie pour chémotype III. Xation.)

DISCUSSION

différenciation chimiotaxonomique-La cession a priori des adhésions à C. sativa et indica C. fondée sur l'origine géographique et les différences dans la fréquence des allèles allozymes est compatible avec les différences dans les niveaux signi.cant cannabinoïdes et les fréquences des allèles BT entre les deux espèces. Reconnaissance des ruderalis C. n'est pas étayée par la preuve, car aucune différence chimiotaxonomiques signi.cant ont été observées entre les accessions rudérales de l'Asie centrale et Europe de l'Est. Ces résultats sont cohérents avec le concept de Vavilov deux espèces et de son interprétation que ruderalis C. est synonyme de C. sativa var.spontanea Vav. (Vavilov, 1926; Vavilov et Bukinich, 1929).


Cette étude c*n.rms que le THC / CBD ratio de plants de cannabis individuel peut être attribué à l'un des trois chémotypes discrets. Les limites entre les chémotypes coïncident avec ceux rapportés par Vollner et al. (1986).Comme prévu, les plantes à des niveaux élevés de THC étaient communes dans les deux biotypes de C. indica drogues. Cependant, les plantes à des niveaux relativement élevés de THC étaient également fréquents dans le chanvre et biotypes sauvages de cette espèce. En revanche, la plupart des plantes assignées à C. sativa avaient des niveaux relativement faibles de THC. Parce que chémotype I, II, III et les plantes ont été trouvés chez les deux espèces, le chémotype d'une plante est d'une utilité limitée pour la détermination de l'appartenance chimiotaxonomiques espèces.

Il a estimé que je chémotype personnes représentaient moins de 25% de chaque population, mais pour tous les deux des 89 accessions attribué à C. sativa et> 25% de chaque population pour tous, mais quatre des 62 accessions attribué à C. indica. Cela semble être une ligne directrice raisonnable pour la différenciation des deux espèces, en collaboration avec d'autres traits taxonomiques. L'avantage de cette méthode sur la des petites et Cronquist (1976) pour différencier sativa indica de (indépendamment du rang taxonomique) est que la fréquence des chémotype je plantes dans une population donnée est stable d'une génération à l'autre (en supposant que Hardy- Weinberg l'équilibre) et non in.uenced par des facteurs biotiques et abiotiques qui influent sur la production quantitative des cannabinoïdes. Pour les populations qui ont été délibérément choisie pour un chémotype. Xe, l'origine géographique et des caractéristiques morphologiques sont de meilleurs indicateurs de l'appartenance des espèces (Hillig 2004, sous presse).

Les petites et Beckstead (1973a) ont signalé que chémotype je souches proviennent généralement de pays du sud de 30oN latitude et que chémotype II et III souches sont généralement issus de pays situés au nord de cette latitude. Dans la présente étude, près de toutes les accessions ayant une fréquence relativement faible BT (<0,4) provenaient de latitudes nord de 35oN. Toutefois, plusieurs accessions avec une fréquence relativement élevée BT (> 0,4) également à l'origine de cette latitude ci-dessus, y compris les adhésions drogue de l'Afghanistan et le Pakistan et adhésions de chanvre en provenance de Chine, le Japon et la Corée du Sud. Il semble que la gamme de C. sativa en Europe et en Asie ne s'étend pas en dessous d'environ 35oN latitude, alors que la gamme d'indicateurs C. s'étend au-dessus et en dessous de cette latitude (Hillig, 2004).

Les homologues de propyle chaîne latérale de la CDB et de THC, sont également des signi.cance chimiotaxonomiques. Des niveaux élevés de CBDV et / ou THCV étaient beaucoup plus fréquentes chez les plantes de C. indica que dans les usines de C. sativa. Les plantes à des niveaux élevés de THCV, dépassant parfois THC, ont été détectées dans les quatre biotypes de C. indica, mais pas chez toutes les accessions. ratios de ségrégation dans les populations F2 issues de croisements contrôlés entre basse et haute personnes THCV indiquent qu'au moins deux locus de contrôle de ce trait (de Meijer et al, 2003;. K. Hillig, données non publiées).Le gène (s) contrôle la biosynthèse accrue des cannabinoïdes propyle semble avoir son origine dans C. indica et de ne pas s'être propagée sensiblement dans C. sativa.

Les petites et Beckstead (1973b) ont rapporté que des plantes de plusieurs accessions de la Chine, le Japon et la Corée du Sud a amélioré les niveaux de CBGM. Ils ont attribué ces adhésions à un chémotype quatrième, mais les petites et Cronquist (1976) ne traite pas ce groupe comme un taxon distinct. Dans la présente étude, un niveau relativement élevé apparent de CBGM était plus fréquente chez les plantes affectées au biotype de chanvre du C. indica. Cette caractéristique semble être un marqueur utile pour différencier chimiotaxonomiques ce taxon.

Aux fins de tests d'hypothèses, Hillig (2004) attribué variétés de chanvre Asie méridionale et orientale de C. chinensis Delile. Bien que les petites et Cronquist (1976) réduit C. chinensis en synonymie avec C. sativa subsp.sativa var. sativa (avec du chanvre européen), une analyse des allozymes fréquences alléliques montre que les adhésions sud et l'est du chanvre asiatiques dans la collection de matériel génétique dans l'étude proviennent de la piscine C. gène indica (Hillig, 2004). En général, les adhésions sud et l'est du chanvre asiatiques se composaient essentiellement de chémotype je plantes, bien qu'elles tendent à produire moins de THC que adhésions affecté à la biotypes de drogue. Ceci est cohérent avec les résultats de Rowan et Fairbairn (1977) qui ont déclaré relativement élevée en THC / CBD ratios, mais à faible teneur en THC dans les plantes issues de graines pour les oiseaux d'origine chinoise. Hong et Clarke (1996) a rapporté que les souches de chanvre cultivé en Chine sont généralement plus faibles en THC que les souches de drogue, mais THC / CBD ratios n'ont pas été signalés. éleveurs de chanvre européennes ont lutté pendant plus de 50 ans pour réduire les niveaux de THC dans le chanvre chinois, en partie parce qu'ils ne reconnaissent pas que le chanvre est de l'Asie est un biotype de C. indica (Bredemann et al., 1956).

Pour les études de systématique, il est préférable d'obtenir des akènes sud et l'est souches asiatiques directement à partir de sources dans ces régions en raison de la possibilité que de telles souches dans les collections de matériel génétique européenne se sont hybridées avec C. sativa. La collection de matériel génétique du cannabis étudiés par les petites et Beck-place (1973b) inclus adhésions étiqueté''gigantea,''sinensis'',''''indica'', et''''himalayana qui ont été obtenus de sources européennes, bien que ces étiquettes indiquent que ces souches étaient d'origine asiatique. Les petites et Beckstead classé ces adhésions que chémotype II ou III populations, en contraste avec des adhésions obtenues directement de la Chine, l'Inde, le Japon et la Corée du Sud, dont plusieurs ont été classés comme chémotype je populations. Quelques souches de la Chine et le Japon avec des ratios relativement élevés de THC / CBD ont été classés avec les souches THC modéré à faible (<0,5% de poids sec), apparemment en raison de leur maturité tardive et de la production de résine faible. Il semble probable que plusieurs des souches précitées que les petites et Beck-lieu obtenu à partir de sources européennes ont été hybridés avec C. sativa et que plusieurs souches du sud et l'est des sources asiatiques qu'ils ont inclus dans la catégorie haute teneur en THC ont été cultivées pendant. Membres et / la production de semences ou, et non pour la production de drogue.

Les différences quantitatives-Les niveaux de cannabinoïdes déclarés dans cette enquête sont environ quatre à. fois ve supérieurs à ceux déclarés par les petites et Beckstead (1973b). Environ 20% des plantes III chémotype avaient des niveaux de THC> 0,30% ps du matériel végétal de l'échantillon, ce qui dépasse le clivage arbitraire établie par les petites et Beckstead entre''non-psychotomimétiques''et''''psychotomimétiques plantes. Cette valeur de 0,3% est utilisé dans plusieurs pays comme une limite supérieure pour les niveaux de THC admissible dans les souches de chanvre industriel (Small, 1999). La présente étude montre que la limite supérieure de 0,8% de THC ps serait plus compatible avec la gamme naturelle de variation entre les plantes III chémotype, basé sur un ps maximale théorique de 16% de la CDB dans in.orescences pistillées et un rapport 1: 20 de THC: CBD.

Bien que cette convention n'a pas été détecté dans certains chémotype je plantes, des analyses séparées de GC dans laquelle des extraits plus concentrés ont été analysés montrent que la CDB a été bien présents dans ces plantes, mais en dessous du seuil de détection dans la présente étude (K. Hillig, données non publiées, Université de l'Indiana). Cela peut également être le cas dans d'autres études qui ont signalé l'absence de la CDB dans les souches de certains médicaments (résumée dans Baker et al., 1980). Environ 5% de THC par rapport à la CDB a été beaucoup produite dans des usines III chémotype, qui est proche de la valeur de 4% déclarés par Fournier et Paris (1980). Raisons pour la production de bas niveau de la CDB dans chémotype je plantes et de THC dans les plantes III chémotype sont inconnus. De Meijer et al. (2003) l'hypothèse que plus d'une variante de la synthase de la CDB à l'acide et / ou des allèles synthase THC-acide sont présents dans le pool génétique du cannabis et que ces variantes allèles allozymes encoder avec différents ef.ciencies catalytique. Ils ont proposé que différentes combinaisons de ces allèles dans la suite quelque peu différente ratios THC / CBD parmi les hétérozygotes (BD / BT) personnes. L'histogramme de la Fig. 3 semble montrer une distribution bimodale chez les plantes II chémotype, compatible avec cette hypothèse. Toutefois, seuls deux allèles (BD et BT) ont été déduites de la CDB et le THC profils de bandes visualisées par électrophorèse sur gel d'amidon.

Barni-Comparini et al. (1984), l'absence complète de la SRC à chémotype II et III plantes. Dans la présente étude, la SRC a été détecté dans les trois chémotypes mais pas dans toutes les usines. La forte corrélation (r = 0,79) entre la SRC et les niveaux de la CDB dans le chémotype II et III des plantes n'a pas été signalée auparavant. Curieusement, les plus hauts niveaux de la SRC ont été détectés dans staminées. Eurs de chémotype je plantes assignées au biotype de chanvre du C. indica (K. Hillig, données non publiées, l'Université d'Indiana).

La domestication et l'évolution-petites et Cronquist (1976) suppose que les taxons sativa indica et ont divergé en raison principalement de la sélection de l'homme pour. Nombre et / ou de production de semences, d'une part et pour la production de THC élevé sur l'autre. Toutefois, la présente enquête ne confirment pas cette hypothèse. La fréquence élevée de BT dans le biotype sauvages de C. indica suggère que cet allèle peut avoir été présente à haute fréquence dans la piscine C. gène indica avant la domestication. sélection de plantes de l'homme portant deux copies de l'allèle BT ne semble être de signi.cance appréciable dans la domestication du biotype NLD.sélection de l'homme peut avoir entraîné une augmentation des niveaux quantitatifs de cannabinoïdes produits par le biotype WLD, mais le montant moyen de la CDB + THC produit par le biotype LND n'a pas signi.cantly différer de chanvre et de biotypes sauvages de C. indica. En fait, la quantité moyenne de THC + CDB produites par les adhésions LND n'a pas été signi.cantly supérieur au montant moyen de ces deux cannabinoïdes produits par les adhésions de chanvre de C. sativa. Les petites et Beckstead (1973b) ont également déclaré des niveaux comparables de cannabinoïdes total dans leur psychotomimétiques''''et''''souches non-psychotomimétiques.Plantes de meilleurs niveaux de THCV étaient rares dans la plupart des adhésions de drogues, sauf ceux de l'Afrique australe et l'adhésion de l'Afghanistan. Ceci suggère que les humains peuvent avoir sélectionné contre ce trait de souches cultivées.

En contraste avec le biotype NLD, le biotype WLD n'avait pas une fréquence plus élevée de BT signi.cantly que le chanvre et biotypes sauvages de C. indica. Cela peut s'expliquer par les différents produits obtenus à partir des deux biotypes de C. indica drogues. NLD souches sont généralement cultivées pour la production de marijuana (in.orescences pistillées), et il est le produit d'une seule plante qui est utilisée. WLD souches sont traditionnellement cultivées pour la production de haschisch (détaché trichomes glandulaires), qui est le produit combiné de nombreuses plantes. Un plant de marijuana à des allèles deux CD (chémotype III) serait inefficace pour l'usage prévu, alors que le haschich fait d'une population de chémotype I, II, III et les particuliers contient généralement plus de THC que la CDB et selon les proportions des différents chémotypes est plus ou moins psychoactives (Ek et al, 1972;. Clarke, 1998). Ainsi, la sélection de l'homme devrait favoriser les plantes chémotype I comme sources de semences pour la culture de la marijuana, alors que les chémotypes de plantes isolées cultivées pour la production de haschich sont généralement inconnus du cultivateur (Clarke et Watson, 2002).

La présence de l'allèle BT dans la piscine C. sativa gène suggère que l'introgression de C. indica pourrait avoir joué un rôle dans l'évolution de C. sativa. pollen par le vent peuvent avoir contribué à l'allèle de migration entre les deux pools de gènes (Cabezudo et al., 1997). Relativement hautes fréquences BT (gamme de 0.38 à 0.55) ont été détectés dans sept accessions de chanvre en provenance de Turquie, l'Espagne, l'Italie, l'ex-Yougoslavie, et le sud de la Russie, qui sont cédés au groupe sud éco-géographique de C. sativa (Davidyan, 1972). D'autres marqueurs allozymes et des caractéristiques morphologiques typiques de C. indica ont également été observées dans le groupe sud de C. sativa (Hillig 2004, sous presse). Cannabis indica peut avoir été introduit en Asie Mineure aux fins de la production de haschisch et hybrides avec C. sativa. Davidian (1972) a cité des preuves que le cannabis a été introduit en Europe la fois par un Nord et la route du Sud. introgressés stock a pu se propager dans de nouveaux domaines à travers le commerce ou la migration de l'homme (Heiser, 1973).

Les patrons de variation cannabinoïdes fournir la preuve de relations progéniteurs dérivés. La faible fréquence de BT et les faibles niveaux de cannabinoïdes dans propyle adhésions attribué à C. ruderalis suggèrent que ce taxon putatif pourrait être l'ancêtre de C. sativa, mais pas du C. indica. Le biotype sauvages de C. sativa peut être composée de''échappé''les populations de C. sativa cultivées qui ont fusionné avec les populations naturalisées de ruderalis C. (Vavilov, 1926). La vaste gamme de variation des cannabinoïdes dans les accessions sauvages de C. indica suggère que ce pourrait être biotype l'ancêtre de la biotypes cultivées de C. indica. L'incidence élevée des plantes de ce taxon de meilleurs niveaux de cannabinoïdes propyle suggère que ce n'est pas l'ancêtre de C. sativa, dont les plantes de meilleurs niveaux de cannabinoïdes propyle sont beaucoup moins fréquents. Il est peu probable que le biotype sauvages de C. indica représente une évasion de souches de la NLD de la culture parce que le biotype NLD manque de variation des cannabinoïdes. La fréquence élevée de BT dans le biotype de chanvre du C. indica suggère la possibilité que des médicaments biotypes un ou les deux pourraient avoir été secondairement provenant du fonds génétique de ce taxon. Plus populations sauvages et cultivées de C. indica et sativa C. devra être étudiée davantage résoudre ces problèmes.

Cette étude de la variation des cannabinoïdes soutient un concept de deux espèces de cannabis. Une révision taxonomique qui s'applique valide noms corps scientifiques pour les biotypes de C. indica reconnu dans ce document est appuyé par les données chimiotaxonomiques.

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[smooth]

Petit plus trouvé lors de la traduction qui suivait l'article du dessus) :

FIN-314 au Canada

Regina, Saskatchewan, Canada

Dans les éditions précédentes de ce journal, Jace Callaway et Tero Laakkonen ont signalé (par exemple, Callaway et Laakkonen 1996, 1999 sur le développement et le progrès de leur variété nord de chanvre oléagineux connu sous le nom «FIN-314. Avec l'avènement de la culture du chanvre commercial légal au Canada au printemps dernier, «FIN-314 a été un choix évident pour les producteurs de chanvre nouveau ici, dont beaucoup étaient à la recherche d'une variété facile à la récolte des graines de chanvre. Jace Callaway et Tero Laakkonen étaient au courant de ce fait et avait suivi l'évolution au Canada de près. Toutefois, comme la variété a été multipliée seulement en Finlande depuis 1995, la fourniture de semences finlandais a été suffisante que pour permettre la multiplication d'autres avant de pouvoir être pleinement commercialisé. Pour cette raison, il est devenu nécessaire de travailler en partenariat avec un groupe de producteurs de chanvre biologique au Canada qui pourraient mener à bien cette directive.

Au début de 1998, une alliance s'est forgée entre Callaway, Laakkonen, et un groupe de producteurs, les négociants et les chercheurs connu sous le nom de Gen-X Research Inc, aux fins de l'introduction de la variété de chanvre "FIN-314 à destination du Canada. Basée à Regina, en Saskatchewan, Gen-X recherche coordonne aujourd'hui la distribution de semences de plantation "FIN-314» pour les producteurs de chanvre canadiens, et les agriculteurs marchés bénéficiaires de chanvre "grain" de production.

L'aventure a été une réussite jusqu'à présent. Maintenant, dans notre deuxième année de production, "FIN-314 est cultivé sur une superficie totale d'environ 300 hectares, à divers endroits: à partir de la Colombie-Britannique sur la côte Ouest, en Nouvelle-Écosse à l'Est, et de la pointe sud de l'Ontario à 42 degrés de latitude nord, à la région de Peace River au nord de la Colombie-Britannique et en Alberta à 56 degrés de latitude nord (Young, 1999). Jusqu'à présent, notre expérience avec cette variété ont confirmé et renforcé les observations positives faites dans les rapports précédents, ainsi que soulevé des questions intéressantes.De toute évidence, «FIN-314 est une souche unique et précieux, tant du point de vue du producteur de chanvre et du point de vue de la nutritionniste. La demande pour les graines de cette variété ont largement dépassé la disponibilité de cette année, mais avec un peu de chance, nous nous attendons à être en mesure de fournir «FIN-314« semences d'environ 5000 hectares de production de l'année 2000.

Fibre vs semences

Toutes les variétés de chanvre actuellement commercialisé au Canada ont été développés et homologués en Europe (principalement en France et en Hongrie). Il est difficile de comparer "FIN-314 à l'une de celles-ci, pour des raisons qui seront détaillées ci-dessous. En outre, il n'existe aucune trace de types court stature productrices de semences de chanvre jamais cultivé en Amérique du Nord. En Europe, les efforts de sélection de chanvre ont concentré jusqu'à récemment sur l'augmentation du rendement et la proportion de fibres, la création de variétés monoïques, et la réduction de la teneur en THC. La production de semences a été la plupart du temps considérée comme un objectif secondaire, l'objectif principal était de servir de matériel de semis pour l'année suivante.

traitement des fibres de chanvre est en train de faire un retour en force comme une industrie, mais a un très long chemin à parcourir. traitement des fibres est complexe, elle nécessite un apport en capital élevés et des années de recherche et de développement. Les frais de transport peuvent être prohibitifs. D'autre part, de nouveaux marchés se sont rapidement créés pour les produits de graines de chanvre dans les aliments, les cosmétiques et les secteurs de la nutrition. Ainsi, il est attrayant pour de nombreux agriculteurs canadiens, qui peuvent voir la production de paille de chanvre comme secondaires ou indésirables, principalement pour cultiver du chanvre pour ses graines. Il n'a guère de sens, dans leur cas, d'augmenter les types prédominants de chanvre, qui passera à n'importe où de deux à quatre mètres de hauteur, mais la production de semences seulement dans les usines 'top 40 cm.Cela crée des difficultés techniques lors de la récolte, et exige une préparation minutieuse. En outre, de chanvre en paille laissée sur le sol ne se dégrade pas rapidement dans les fermes conventionnelles (où les applications chimiques peuvent avoir freiné l'activité fongique et bactérienne) et peut être une nuisance tout en essayant de cultiver une culture sur le même champ l'année suivante.

Aussi étrange que cela puisse paraître, de nombreux agriculteurs des Prairies de chanvre qui cultivent des variétés de chanvre hauteur n'auront guère le choix, mais à s'accumuler leur paille dans le domaine et de le brûler après la récolte des graines, comme ils le font avec leur paille de lin oléagineux. Il n'est pas difficile de voir cela comme un gaspillage. Pour cette raison et d'autres, il existe une demande croissante de types de semences à court stature de chanvre. Actuellement, "FIN-314 est la seule variété disponible répondant le projet de loi.Plusieurs nouvelles variétés sont développées pour répondre à la demande, mais ceux-ci ne devrait pas être disponible pour au moins un an ou deux.

Un démarrage tardif

Les retards bureaucratiques avec le bureau des permis du chanvre au Canada et aux règlements douaniers retardé l'importation de notre lot de «FIN-314« semences issues de la production finlandaise Callaway et Laakkonen jusqu'à la fin de Juin, 1998. Connaissant la réputation de cette variété pour une maturité précoce, nous sommes allés de l'avant et a planté la graine de toute façon. Deux parcelles de multiplication ont été semées sur des terres de culture biologique: un dans le sud du Québec (4 ha, 29 Juin), et l'autre en Saskatchewan (14 ha, 1er Juillet). Petites parcelles de recherche ont également été ensemencée par des tiers pour une évaluation agronomique, dans le sud et le nord de l'Ontario, le nord de la Colombie-Britannique et en Alberta.

Personne n'a été tout à fait sûr de savoir si une culture de semences viables serait obtenu à partir de cette plantation sans précédent en retard. Cependant, notre frustration devant les retards ne tarda pas à disparaître, que la croissance des plantes coups de pied à la vitesse supérieure, avec une moyenne d'environ 2 cm par jour pour le mois de Juillet.Incroyablement, sur notre site principal (Saskatchewan), les fleurs mâles est apparu au jour 21, et a commencé à libérer leur pollen au jour 27, tout comme les plantes femelles ont commencé à fleurir. Malgré les semis tardifs, tous les sites mûri au sein de 78 à 90 jours, et étaient prêtes à être récoltées à la fin Septembre. taille des végétaux à l'échéance varie d'environ trois à quatre pieds et demi: extrêmement court pour le chanvre, encore une hauteur très maniable pour le grain standard des machines de récolte. Les rendements de céréales variait d'environ 300 kg / ha (en frappées par la sécheresse de la Saskatchewan) à 1100 kg / ha (Québec). Il est prévu que les rendements augmenteront de manière significative cette année, avec la plantation au bon moment et notre meilleure compréhension de la culture.

Hauteur de la plante contre Latitude

Cannabis sativa présente habituellement trois phases distinctes de la croissance: au stade plantule, le stade de croissance végétative et la période de floraison. Le stade végétatif commence lorsque la plante de chanvre a formé ses premières feuilles, et s'étend jusqu'au début de la floraison. C'est au cours de cette période que les plantes de chanvre mis toute leur énergie dans la croissance verticale, un taux au cours de laquelle d'autres plantes ou les mauvaises herbes ont du mal à suivre. chanvre à floraison tardive est habituellement préféré pour la production de fibres: plus la phase de croissance végétative, plus le rendement tige.

Après le stade végétatif vient le stade de la floraison, dans une variété dioïque, fleurs mâles premières plantes, et les femmes de suivre environ deux semaines plus tard que les hommes se préparent à libérer le pollen. Une fois établit floraison, les plantes de chanvre commencent généralement ralentissement de leur croissance verticale et de concentrer leurs énergies sur le pollen et la production de semences à la place.

D'après ce que nous avons observé jusqu'ici, il semble que 'FIN-314' donne une courte stade végétatif très, si tant est qu'il peut être appelé ainsi. Cette variété, pas comme les autres, nous avons observé, saute essentiellement de la période végétative et va directement à partir des semis à la floraison. Les fleurs mâles commencent à apparaître environ trois semaines à partir de semis et les plantes passent le plus clair de leur cycle de croissance 85-90 jours dans le stade de la floraison . La croissance verticale se poursuit sans interruption, même si les plantes sont en fleurs. Nous avons également observé que le plus au sud "FIN-314 est cultivée, la plus courte c'est la taille finale. À Regina, en Saskatchewan (à 50 degrés de latitude nord), notre récolte a atteint des sommets d'environ 1,2 mètres (maximum) - un peu plus courte que le mètre maximum 2 qui a été signalé pour les cultures finlandaise (plus de 60 degrés de latitude Nord). Et plus au sud, par exemple, près de Montréal, au Québec, à environ 45 degrés de latitude, notre récolte a terminé à environ 80 cm - 1,0 m.

En plus des données obtenues à partir de nos sites de test officiel, la rentrée accidentelle de croissance de plantes de chanvre à partir de semences renversé lors de la récolte de l'an dernier a révélé quelques informations inattendues. Sur le site mentionné précédemment au Québec, un stand d'épaisseur de "volontaire" a été découvert des plants de plus en plus au début d'avril de cette année dans un endroit abrité par les bâtiments de ferme. Comme cet article est rédigé (début Juin), une époque où de nombreux agriculteurs sont encore en train de planter leurs cultures, des graines mûres a déjà été produite par ces installations. Cette maturation extrême début ne peut pas être du jamais vu pour le Cannabis sauvage, mais à notre connaissance, est sans précédent pour le chanvre domestiques au Canada. Tout cela peut avoir des conséquences surprenantes pour les producteurs de graines de chanvre, et soulève de nouvelles questions à la recherche. Théoriquement, même si pas forcément pratique, il peut être possible d'obtenir deux récoltes de semences FIN-314 'd'un champ en un an, dans une grande partie du sud du Canada et les États-Unis. À tout le moins, cette variété a une fenêtre de plus l'époque des semis et une large aire géographique de production de semences que les autres variétés. Cependant, il ya encore beaucoup de recherches à faire pour déterminer l'effet de la latitude, la température et l'époque des semis sur les rendements des semences potentiels.

faible rendement, de haute qualité: fibre


En conséquence de sa période de croissance à court, «FIN-314 'donne des rendements de paille faible. Cependant, parce que les plantes sont minces et non ramifiées comme le lin, les tiges contiennent une forte proportion de fibres longues primaires. Ces tiges ressemblent tellement à du lin lin qui il semble probable qu'ils puissent être traitées par la même extraction et de machines de filature, si elle s'avère rentable de le faire. Les essais seront effectués cet automne, dans un effort de collaboration entre les producteurs du Québec de chanvre »FIN-314 et Fibrex Québec Inc, qui ont acquis l'ancienne usine Gilflax à Valleyfield, pour déterminer la pertinence des tiges de chanvre" FIN-314 »pour les la transformation en textiles de lin. Nous espérons que ce pourrait accroître considérablement les revenus de nos producteurs de chanvre dans l'avenir.

Résultats des essais

résultats de l'analyse du THC obtenus en 1998 ont été légèrement supérieurs à ceux signalés en provenance de Finlande, mais bien dans la limite de 0,3%: les tests enregistrés entre 0,06% et 0,16% au Canada, comparativement à 0,04% à 0,08% en Finlande. Les résultats des tests plus élevés ont été généralement obtenus à partir endroits plus au sud. Ceci est en accord avec les conclusions de Scheifele et al. (1999a), qui montrent la tendance des concentrations en THC inférieures aux latitudes élevées.

Profil des acides gras

Peu d'autres huiles alimentaires, même l'approche du profil d'acide gras d'exception dans l'huile de graines de chanvre. «FIN-314 'en particulier, semble produire de l'huile de qualité supérieure en termes de profil d'acides gras essentiels. La recherche a confirmé la teneur élevée en acide gamma-linolénique (GLA) et l'acide stéaridonique (SDA) contenu dans l'huile extraite de "FIN-314 'de semences cultivées au Canada. Les résultats des tests variait de 4,2 à 4,7% et GLA 1,5 à 1,8% SDA dans l'huile, par rapport à un maximum de 3,1% et 1,0% GLA SDA pour les autres variétés testées. Ces niveaux élevés sont probablement aussi lié à FIN-314 est originaire du nord, comme on le verra par Callaway et al. (1996).

Les graines de chanvre sont également connus pour être une bonne source de protéines faciles à digérer. Deux essais séparés sur «FIN-314 'graines ont produit une lecture protéine de 31% sur une base de graines entières et de 35,8% sur le gâteau de chanvre, respectivement (après élimination de l'huile). Teneur en huile testée à 26% (Scheifele 1999b), un peu plus bas que les 37% rapportés par Callaway et Laakkonen (1996). D'autres tests sont nécessaires pour déterminer la raison de cette variation. Il semble possible que la saison abrégée de plus en plus en 1998 est responsable de cela. Étant donné plus de temps à mûrir, teneur en huile des graines peut être plus élevé.

Conclusion

«FIN-314 est très différent des autres cultivars de chanvre est actuellement approuvé, mais il est particulièrement approprié pour la production de semences au Canada: il peut produire des graines viables dans une région du Canada où la terre est cultivée. Il est particulièrement approprié pour les régions les plus septentrionales l'agriculture. Il démontre également une flexibilité supérieure en termes de dates de semis. Récolte mécanique des «FIN-314« semences est très simple, en raison de la stature des plantes à court et à maturation précoce.«FIN-314 'présente également des caractéristiques nutritionnelles supérieures. Tous ces facteurs nous amènent à attendre la demande pour cette variété d'augmenter au cours des prochaines années.

Références

Callaway, Laakkonen JC et TT 1996. La culture de variétés de cannabis graines oléagineuses en Finlande. Journal de l'Association internationale du chanvre 3 (1): 32-34.

Callaway, Laakkonen JC et TT 1998. Mise à jour sur «FIN-314. Journal de l'Association internationale du chanvre 5 (1): 34-35.

Callaway, JC Tennilä T., et DW Pate 1996. Présence d '«oméga-3' acide stéaridonique dans les graines de chanvre Journal de l'Association internationale du chanvre 3 (2): 61-63.

Scheifele, 1999a Gordon. 1998, des études de l'Ontario dans la détermination de la stabilité génétique, l'environnement et effet de la latitude sur le niveau de delta-9 THC des variétés de chanvre industriel. Collège de Kemptville, Université de Guelph, à Thunder Bay, en Ontario.

Scheifele, 1999b Gordon. Rapport final de déterminer la faisabilité et le potentiel de production du champ de chanvre à faible teneur en THC industriel (Cannabis sativa) pour la fibre et des graines de semence dans le nord de l'Ontario. Collège de Kemptville, Université de Guelph, à Thunder Bay, en Ontario.

* Young, 1999 Jane. Conseil de bande Gitsegukla chanvre Résumé Rapport de projet. Corp Gitsegukla Développement économique, de Hazelton en Colombie-Britannique Sud.

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et ça continue encore et encore c'est que le début d'accord d'accord !!

4ème Fiche:

La cristallisation de Delta 1 )-synthase tetrahydrocannabinolic acide (THCA de Cannabis sativa
Shoyama Yoshinari, une Ayako Takeuchi, une Taura Futoshi, une Tamada Taro, b Adachi Motoyasu, b Ryota Kuroki, b Yukihiro Shoyama, une Satoshi Morimoto et une *
une faculté des sciences pharmaceutiques, Université de Kyushu, 3-1-1 Maidashi, Higashi-ku, Fukuoka 812-8582, Japon
b Neutron Science Research Center, le Japon Energy Research Institute atomique, 2-4 Shirakata-Shirane, Tokai, Ibaraki 319-1195, Japon

Résumé
DELTA 1 Tetrahydrocannabinolic acide-(THCA) synthase est une nouvelle oxydoréductase qui catalyse la biosynthèse du composé psychoactif THCA de Cannabis sativa(souche mexicaine). Afin d'étudier la relation structure-fonction de la synthase THCA, cette enzyme a été surproduit dans des cellules d'insectes, purifié, et enfin cristallisé dans 0,1 M de tampon HEPES pH 7,5 contenant 1,4 M de citrate de sodium. Un cristal unique adaptée à la mesure de diffraction des rayons-X a été obtenu dans 0,09 M de tampon HEPES pH 7,5, contenant 1,26 M de citrate de sodium. Le cristal diffractée à 2,7 Å de résolution au BL41XU ligne de lumière, printemps-8. Le cristal appartient au groupe espace cubique primitive P 432, avec des cellules paramètres de l'appareil une = b = c = 178,2 Å. Le coefficient a été calculé Matthews environ 4,1 ou 2,0 Å 3 Da -1 supposant la présence d'une ou deux molécules de synthase THCA dans l'unité asymétrique, respectivement.
Mots-clés: Δ 1 acide synthase tetrahydrocannabinolic-
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1.  Introduction
Les cannabinoïdes, qui ne se trouvent que dans Cannabis sativa , sont des métabolites secondaires consistant en alkylresorcinol et des groupes de monoterpènes. Plus de 60 cannabinoïdes ont été isolés à partir de la marijuana ou frais Cannabis feuilles et leurs propriétés pharmacologiques ont été largement étudiés (Turner et al. , 1980 ). Parmi eux, Δ 1 -tétrahydrocannabinol (THC) est le composant psychoactif de la marijuana (Gaoni & Mechoulam, 1964 ). En outre, ce cannabinoïde est représenté à exercer une variété d'activités thérapeutiques telles que le soulagement des nausées causées par la chimiothérapie anticancéreuse (Guzman, 2003 ) Et la suppression de la spasticité et la douleur associée à la sclérose en plaques (Baker et al. , 2003 ). Ainsi, parce que le THC a attiré beaucoup d'attention, divers produits chimiques, pharmacologiques et des études de biosynthèse ont été menées sur ce cannabinoïde (Mechoulam, 1970 , 2000 ).
THC s'accumule habituellement à un très faible niveau dans les feuilles fraîches deC. sativa et est représenté à tirer artificiellement à partir de l'acide cannabinoïdes Δ 1tetrahydrocannabinolic acide-(THCA) par décarboxylation enzymatique non pendant le stockage et le tabagisme (Yamauchi et al. , 1967 ; Kimura et Okamoto, 1970 ).Nos études ont démontré que la biosynthèse THCA, qui avait été considéré comme formé par isomérisation de l'acide cannabidiolique (CBDA), était en fait dérivé de l'acide cannabigerolic (CBGA; Taura al. et , 1995 , 1996 ; Fig. 1 ). En outre, nous avons identifié et purifié une oxydoréductase THCA synthase qui catalyse la biosynthèse nommé THCA en expansion rapide des feuilles de C. sativa (Taura et al., 1995 ). enquête biochimique utilisant l'enzyme purifiée établi que synthase THCA cyclise par oxydation du groupement monoterpène de CBGA à stéréospécifique forme THCA (Taura et al. , 1995 ; Sirikantaramas et al. , 2004 ). Parce que les enzymes catalysant une telle oxidocyclization n'ai pas été identifiés à ce jour, il est d'un grand intérêt pour justement révéler la structure de la synthase THCA et de comprendre le mécanisme de la réaction synthase THCA.




Figure 1
THCA biosynthèse. synthase catalyse THCA cyclisation oxydante de la fraction de monoterpènes CBGA pour former THCA. THC est dérivé de THCA par décarboxylation non-enzymatique.
Nous avons récemment cloné le gène codant pour THCA synthase et déduit de son-séquence d'acides aminés. Lorsque nous avons analysé les caractéristiques de sa structure primaire (Sirikantaramas et al. , 2004 ), Il est devenu évident que synthase THCA contient une flavine site de liaison et n'a pas d'homologie avec les protéines dont les structures cristallines ont été déterminées. Bien que la mutagenèse dirigée a révélé la présence de la FAD dans synthase THCA être cruciale pour oxidocyclization de CBGA, les résidus d'acides aminés impliqués dans cyclisation stéréospécifique de la fraction monoterpènes ont toujours pas été identifiés. Par conséquent, il est impossible d'expliquer le mécanisme de la réaction synthase THCA sans information structurale tertiaire.
Pour obtenir une connaissance plus précise de la relation structure-fonction de la synthase THCA, nous avons tenté de caractérisation structurale par cristallographie aux rayons X. Ici, nous décrivons la cristallisation et de caractérisation préliminaire des X-ray de la synthase THCA.
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2.  Méthodes
2.1. Expression et purification
Recombinant THCA synthase (Sirikantaramas et al. , 2004 ) A été exprimée comme une protéine sécrétée dans les cellules d'insectes Sf9 (Invitrogen) en utilisant le Bac à Bac Baculovirus Expression System (Gibco, BRL). Le vecteur d'expression THCA synthase a été construit par PCR en utilisant un clone d'ADNc synthase THCA comme modèle (Sirikantaramas et al. , 2004 ). La région codante de 545 résidus a été amplifié en utilisant les amorces 5'-CGGGATCCATGAATTGCTCAGCATTTT-3 'et 5'-CTAGCTGAGCTCTTAATGATGATGCGGTG-3'. Le fragment obtenu a été coupé par les enzymes de restriction Bam HI et Sac I et clonée dans pFastBac1 (Gibco BRL).Sans erreur clones d'ADNc ont été identifiées par séquençage et utilisés pour produire baculovirus recombinants dans des cellules Sf9 (ATCC CRL-1711) qui suit le protocole du fabricant. cellules Sf9 ont été maintenues dans le sérum sans SF 900-II (Gibco, BRL). Pour la production de protéines, les cellules Sf9 ont été ensemencées à une densité cellulaire de 1 × 10 6 cellules ml -1 et infectées par le virus recombinant. Le milieu est généralement récolté sur les 3 jours après l'infection et THCA synthase a été purifiée à partir de surnageant de culture par chromatographie d'échange d'ions. D'échange d'ions de purification a été réalisée sur Toyopearl CM-650 (Tosoh). Le surnageant a été directement appliqué sur une colonne échangeuse d'ions (3,0 x 10,0 cm) équilibrée avec 50 m M de tampon phosphate pH 7,0. Après lavage de la colonne avec le même tampon, la protéine a été élue avec 0,5 M de NaCl dans 50 m M de tampon phosphate pH 7,0. Fractions contenant l'activité synthase THCA ont été recueillies et dialysées contre 50 m M de tampon phosphate pH 7,0. Le dialysat a été appliquée à l'échange d'ions même colonne (1,0 x 15,0 cm). Après la colonne a été lavée avec 50 m M de tampon phosphate pH 7,0, la protéine a été élue avec un gradient linéaire 600 ml de NaCl (0-0,5 M ) à 50 m M de tampon phosphate pH 7,0. protéine éluée a en outre été purifié sur des ressources S (Amersham Biosciences) en utilisant un 0 à 0,5 M gradient linéaire de NaCl à 50 m M HEPES pH 7,5 à un débit de 1 ml min -1 pendant 30 min.
2.2. cristallisation
conditions de cristallisation ont été examinées par le goutte-diffusion de vapeur méthode assise en utilisant Crystal écrans I et II (Hampton Research) à 293 K. gouttes ont été préparés par mélange de 0,2 pi réservoir avec 0,2 pi solution de protéine contenant 20 mg ml -1 synthase THCA dans 10 m M HEPES pH 7,5 et ont été équilibrées par diffusion de vapeur contre une solution de réservoir. Après deux semaines, de petits cristaux de synthase THCA ont été observées dans 0,1 M de tampon HEPES pH 7,5 contenant 1,4 M de citrate de sodium. Enfin, un cristal unique adaptée à la mesure de diffraction des rayons-X ont été obtenues avec une solution de réservoir constitué de 0,09 M HEPES pH 7,5 et 1,26 M de citrate de sodium. La taille du cristal est de 0,1 × 0,1 × 0,1 mm (Fig. 2 ).



Figure 2
Les cristaux de synthase THCA. La barre d'échelle est de 0,1 mm de longueur.
2.3. diffraction des rayons-X analyse
Les cristaux ont été récoltés dans cryoloops et trempés dans 0,1 M de tampon HEPES pH 7,5 contenant 1,4 M de citrate de sodium et 10% de glycérol. diffraction des rayons-X de données ont été recueillies dans un flux d'azote gazeux froid à 100 K en utilisant un système CCD MAR et de rayonnement synchrotron (1,000 Å longueur d'onde) à BL41XU ligne de lumière au printemps-8 (Nishiharima, Japon).L'angle d'oscillation a été de 1,0 ° et le temps d'exposition était de 5,0 s par image.Un total de 180 images de diffraction ont été enregistrés à distance de la caméra de 170 mm et ont été traitées à l'aide HKL 2000 (Otwinowski & Minor, 1997 ).
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3.  Résultats et discussion
synthase THCA surproduits dans la cellule Sf9 a montré une masse moléculaire de 60 kDa sur SDS-PAGE, bien que la valeur théorique de la masse moléculaire calculée à partir de la structure primaire de la protéine déduite de maturité a été un peu plus faible (58,6 kDa de la structure primaire). Comme il ya au moins huit sites de glycosylation potentiels liés-N, le descrepancy dans le poids moléculaire peut résulter de glycosylation de la synthase THCA. Les conditions de cristallisation pour la THCA synthase glycosylée ont été obtenus par la méthode de la matrice clairsemée et optimisé pour produire un cristal unique adaptée à l'analyse aux rayons X. Un tel cristal avec des dimensions de 0,1 x 0,1 x 0,1 mm a été obtenue en 0,09 Mtampon HEPES pH 7,5, contenant 1,26 M de citrate de sodium. Le cristal diffractée à 2,7 Å de résolution au BL41XU ligne de lumière, printemps-8. Les données de diffraction de traitement ont indiqué que le cristal appartient au groupe espace cubique primitive P 432, avec des cellules paramètres de l'appareil une = b = c = 178,2 Å (Tableau 1 ). Le coefficient a été calculé Matthews environ 4,1 ou 2,0 Å 3 Da -1 supposant la présence d'une ou deux molécules de synthase THCA dans l'unité asymétrique, respectivement. Le nombre de réflexions observées était de 371 920, qui ont fusionné pour former 25 211 réflexions uniques avec un R sym de 0,100 (R sym dans la résolution shell était le plus élevé 0,306), une exhaustivité de 93,0% et la multiplicité de l'ordre de 15. Une recherche de l'atome dérivés lourds pour la détermination des phases par remplacement isomorphe multiple (MIR) et / ou longueur d'onde de dispersion anomale multi (MAD) est en cours.
Table 1
Data-collection and reduction statistics
Values in parentheses are for the highest resolution shell.
Space group P432
Unit-cell parameters (Å) a = b = c = 178.2
Solvent content (%) 38 [2 molecules per AU]
69 [1 molecule per AU]
Data collection
 Wavelength (Å) 1.0000
 Beamline BL41XU, SPring8
 Measurement range (°) 180
 No. of frames 180
 Exposure time per frame (s) 5
 Resolution (Å) 2.7
 Total reflections 371920
 Unique reflections 25211
 Redundancy 14.8
  Rmerge 0.100 (0.306)
 Completeness (%) 93.0 (88.3)

Tableau 1
Collecte de données et statistiques de réduction
Remerciements
Nous remercions les Drs K. et D. Maenaka Kohda (Institut médical de Biorégulation, l'Université de Kyushu) pour obtenir des conseils utiles sur la cristallisation de la synthase THCA.
Merci aussi à cause de M. Kawamoto de collecte de données à Spring-8.

Références
• Baker, D., Pryce, G., Giovannoni, G. & Thompson, AJ (2003). Neurol Lancet. 2 , 291-298. [ PubMed ]
• Gaoni, R. & Mechoulam, R. (1964). J. Am. Chem. Soc. 86 , 1946-1947.
• Guzman, M. (2003). Nature Rev Cancer , 3 , 745-755.
• Kimura, M. & Okamoto, K. (1970). Experientia , 26 , 819-820. [ PubMed ]
• Mechoulam, R. (1970). Science , 168 , 1159-1166. [ PubMed ]
• Mechoulam, R. (2000). Curr. Pharm. Des. 6 , 1313-1322. [ PubMed ]
• Otwinowski, Z. & Minor, W. (1997). Enzymol méthodes. 276 , 307-326.
• Sirikantaramas, S., Morimoto, S., Shoyama, Y., Ishikawa, Y., Wada, Y., Shoyama, Y. & Taura, F. (2004). J. Biol. Chem. 279 , 39767-39774. [ PubMed ]
• Taura, F., Morimoto, S. & Shoyama, Y. (1996). J. Biol. Chem. 271 , 17411-17416. [ PubMed ]
• Taura, F., Morimoto, S., Shoyama, Y. & Mechoulam, R. (1995). J. Am. Chem. Soc. 117 , 9766-9767.
• Turner, CE, ElSohly, MA & Boeren, EG (1980). J. Nat. Prod. 43 , 169-234. [ PubMed ]
• Yamauchi, T., Shoyama, Y., Aramaki, H., Azuma, T. & Nishioka, I. (1967). Chem. Pharm. Bull. 15 , 1075-1076.

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5ème fiches:

Les caractéristiques physiques et chimiques des plantes de cannabis cultivés dans le Royaume-Uni de Grande-Bretagne et d'Irlande du Nord à partir de graines d'origine connue
BAKER PB, GOUGH TA, TAYLOR BJ
Laboratoire de l'analyste du gouvernement, la Chambre de Cornwall, London, Royaume-Uni de Grande-Bretagne et d'Irlande du Nord

RÉSUMÉ

Les plantes de cannabis ont été cultivés dans le Royaume-Uni de Grande-Bretagne et d'Irlande du Nord à partir de graines prélevés lors de saisies de cannabis d'origine géographique connue et la chimie. L'apparence physique et les formes brutes cannabinoïdes de la plupart des échantillons de cannabis produite au Royaume-Uni ont été étroitement liés à ceux des parents.

Toutefois, quelques exceptions notables ont été enregistrés. Il y avait de grandes variations dans la teneur en tétrahydrocannabinol réelle entre des plantes de stocks de départ différents et des variations un peu plus petit au sein des groupes issues de l'stocks de départ même. Le cannabis produit au Royaume-Uni était plus élevé d'acide tétra-hydrocannabinolic / ratios tetrahyrocannabinol que du matériel importé.


Introduction

Dans une étude des caractéristiques physiques et chimiques des 1products cannabis importé, Baker et d'autres [1] a montré que l'apparence physique grossier et le motif de cannabinoïdes comme révélé par chromatographie sur couche mince (CCM) en corrélation avec l'origine géographique de la plupart des échantillons examinés. Par conséquent, si ces caractéristiques d'un échantillon d'origine inconnue ont été comparées à celles d'échantillons d'origine connue, un avis quant à l'origine géographique de l'échantillon inconnu peut être formé. Ces informations peuvent être utiles dans les enquêtes criminelles relatives à des importations illicites Cannabisproduct et peut contribuer à la lutte internationale de la substance [2-5]. Il peut aussi être d'une importance considérable pour savoir si une saisie effectuée au Royaume-Uni était d'origine étrangère ou si le matériel a été cultivé dans le Royaume-Uni. Il est donc nécessaire d'étudier les caractéristiques physiques et chimiques du cannabis cultivé au Royaume-Uni et en particulier, à examiner les tendances des cannabinoïdes de plants de cannabis cultivés dans le Royaume-Uni à partir de graines qui ne sont pas seulement de l'origine géographique connue, mais qui sont également dérivés à partir d'échantillons de cannabis importés de modèle cannabinoïdes connus et le contenu.

Les graines de cannabis qui peut être cultivée dans le Royaume-Uni peuvent être tirés de trois sources principales: (a) à partir de semences vendues au Royaume-Uni pour les poissons-appâts ou de graines pour oiseaux; (b) à partir d'échantillons de cannabis importés, et (c) de la fertile semences produites à partir de plantes cultivées au Royaume-Uni. Semences vendues légalement dans le Royaume-Uni ont montré des taux de germination [6] et sont donc peu susceptibles d'être largement utilisé par ceux qui sont engagés dans la culture illicite de cannabis. La majorité des saisies de cannabis examinés au Laboratoire du gouvernement Chemist, Londres, contenait des graines fertiles. Ce sont, toutefois, peu probable qu'elles aient été incorporées dans les cigarettes comme ils l'avaient négligeable ou nulle, la teneur en cannabinoïdes [[6], [7]] et ils ont ainsi fourni une source immédiate de graines fertiles pour la culture. Il était également nécessaire d'étudier les caractéristiques physiques et chimiques des plantes issues de graines fertiles qui se sont produits au Royaume-Uni.

Un nombre limité d'études de plants de cannabis cultivés dans le Royaume-Uni à partir de graines d'origine connue ont été apportées. De Faubert Maunder [8] a fait une étude comparative, par CCM, de la teneur en tétrahydrocannabinol (THC) d'une saisie de cannabis importé du Nigeria avec les plantes cultivées dans le Royaume-Uni à partir de graines qui y sont contenues. La saisie d'origine et les frères et sœurs ont tous montré le même modèle de base de cannabinoïdes, à savoir l'absence de cannabidiol (CBD) et la présence de THC.Bien que TLC est essentiellement non-quantitatives, de Faubert Maunder estime que les frères et sœurs tous contenaient moins de THC que le parent. Une deuxième étude de plantes issues de graines provenant d'une saisie de cannabis en Afrique du Sud a donné des résultats similaires. Fairbairm et d'autres [9] a augmenté de plantes provenant de graines d'origine connue (bien que le schéma cannabinoïde n'a pas été publié) et a examiné le contenu cannabinoïdes des plantes qui en résulte. Une souche népalaise augmenté au cours des différentes ont montré différents CDB et des teneurs en THC, mais très semblable CBD / ratios THC. Une souche turque contenait principalement la CDB sans teneur en THC signalés, et une souche thaïlandaise contenues principalement THC avec une petite quantité de la CDB. Les auteurs enregistrés que les cannabinoïdes produits dans les usines principalement comme leurs acides. Ces mêmes auteurs ont également observé [10] que les conditions de la croissance affecté la teneur en cannabinoïdes en montrant que les plantes cultivées dans les serres ont différentes teneur en THC de plantes cultivées à partir de la même graine à l'air libre. On a pris soin d'échantillonnage des travaux antérieurs avaient montré [9] que les différentes parties de la même plante avait différents contenus canna-binoid.

Fairbairn et Liebmann [11] ont augmenté de 12 souches de cannabis en plein air dans le sud de l'Angleterre et a constaté des écarts considérables entre les plantes de la même souche grandi ensemble et récoltées en même temps. Des variations considérables dans les plantes ont été une fois de plus noté. Toutefois, les rapports de base de cannabinoïdes est resté le même dans les plantes de la même souche, malgré ces variations quantitatives. Résultats des autres groupes de travailleurs qui avaient grandi les plantes provenant du même lot de semences dans les différentes régions du monde ont indiqué que la même image qualitative du modèle de cannabinoïdes a toujours fait preuve [[7], [12], [13]]. Sur la base de ces observations, Fairbairn et Liebmann [11] a suggéré qu'il pourrait y avoir deux courses chimique des plantes de cannabis, l'une étant THC-riche et l'autre de la CDB riches. Ils ont estimé que ce rapport était indépendante des conditions environnementales, mais qualifiés leur opinion en suggérant que plusieurs générations de plantes doivent être cultivées pour le confirmer.

Rowan et Fairbairn [[6], [14]] a présenté d'autres preuves de l'existence de deux races chimiques du cannabis dans une étude des modèles de plants de cannabis cannabinoïdes.modèles THC-riche et la CDB riches se sont avérés être établie lorsque les plantes sont petites. Dans la souche THC-riche, cannabichromene (CBC) était présent, alors que dans la souche de la CDB riches, Radio-Canada était absent.

Il ya eu un certain nombre d'études de plants de cannabis cultivés à partir de graines d'origine connue dans d'autres parties du monde. Fetterman et autres [7] dans une étude de semences du Mexique et Turquie cultivés dans le Mississippi, États-Unis d'Amérique, a proposé que Cannabisplants se divisaient en deux groupes qui ont été qualifiées de phénotypes, correspondant à des plantes productrices de fibres et de producteurs de drogue. Ces auteurs ont suggéré que les phénotypes doivent être classés comme phénotype I (médicaments de type) si le rapport (% de THC +% CBN) / (% de la CDB) a été supérieure à 1,0 et le phénotype II (fibres de type) si ce ratio est inférieur à 1.0. Toutes les plantes d'origine connue et de l'histoire pourraient être classés à l'aide de ce système; plantes uniquement de l'histoire inconnue ne pouvait pas être classées dans cette catégorie et les auteurs suggèrent que ces échantillons auraient pu contenir des mélanges de différents types de cannabis. De leurs données, les auteurs ont conclu, le phénotype d'une variété de cannabis reste la même quel que soit l'année de la plantation ou le lieu de la croissance de l'échantillon analysé. Dans une étude connexe, Doorenbos et d'autres [15] ont trouvé la plupart des échantillons d'avoir un rapport phénotype supérieur à 5 ou inférieur à 0,2. Ils ont conclu, à la suite de leurs études de la teneur en cannabinoïdes de plantes de la même variante cultivées dans des pays différents et de plantes cultivées à travers trois générations, que les facteurs environnementaux ne sont pas aussi important que l'hérédité dans la détermination des profils cannabinoïdes du cannabis. Les auteurs ont noté les différents contenus des cannabinoïdes dans les plantes de la même variante cultivées dans des conditions différentes et que la plupart des cannabinoïdes étaient présents en tant leurs acides.

Ohlsson et d'autres [16], dans une étude de plants de cannabis cultivés en Suède, a conclu que le type de cannabinoïdes produits par l'usine dépend de la graine et que l'influence du climat a été limitée. Turner et Hadley [17] a augmenté de trois générations de plantes provenant de graines originaires de l'Afrique du Sud et a noté une certaine fluctuation de la teneur en cannabinoïdes, en particulier une augmentation dans l'éther monométhylique cannabigerol (CBGM) pourcentages. Les auteurs soulignent qu'aucune tentative a été fait pour éviter la pollinisation croisée et ainsi de l'importance de l'augmentation de la teneur CBGM (un cannabinoïde dans les usines du nord-est de l'Asie [18]) ne peut pas être correctement évalués. Les petites et Beckstead [12] a augmenté de 350 plantes différentes graines à Ottawa, au Canada et a augmenté le nombre de phénotypes par l'ajout d'un troisième groupe où CBD / THC = 1,0 et un quatrième groupe du nord-est de l'Asie contenant CBGM. Ces auteurs phénotype en corrélation avec la latitude de la source de graines comme suit: phénotype I du sud de 30 ° N avait THC> 0,3% et la CDB <0,5% et des plantes femelles similaires dans la teneur en cannabinoïdes de plantes mâles; phénotype II avait THC> 0,3% (chez les plantes femelles) et la CDB> 0,5% et provient du nord de 30 ° N avec des plantes femelles de la teneur en cannabinoïdes beaucoup plus élevé que les hommes; phénotype III avait THC <0,3% et la CDB> 0,5%, mais a été par ailleurs semblable à phénotype II, et le phénotype IV contenues CBGM. Les auteurs ont considéré que le climat peut affecter la quantité réelle de THC dans une usine, avec un emplacement plus au sud-dire une plus longue saison de croissance résultant dans la plupart des haut-THC (la drogue-type) des plantes produites à partir de graines originaires du sud de 30 ° N.Krejci et d'autres [19] ont montré que les graines de plantes à fibres turque de production, même lorsqu'elles sont cultivées dans des conditions favorables ne produisent pas des quantités appréciables de THC et que les semences issues de l'Afrique du Sud et la Thaïlande (médicament de type), même lorsqu'elles sont cultivées dans des conditions défavorables , toujours produit des quantités relativement importantes de THC. Boucher et d'autres [20] a grandi en Afrique du Sud Cannabis en France et a observé qu'il y avait deux types, soit de l'acide tetrahydrocannabinolic (THCA) riche en acide ou tetrahydrocannabinvarinic (THVA)-riche, une observation a également enregistré par le terrain et Arndt [21] et Baker et d'autres [1]. Après trois générations, cependant, toutes les plantes riches en THVA devenu THCA riches, ce qui indique que THCA / ratios THVA peut-être sous le contrôle de l'environnement. Les deux Novotny et d'autres [22] et Turner et d'autres [23] a suggéré que les cannabinoïdes mineures pourraient être susceptibles de variations lorsque les plantes ont été cultivées dans des environnements différents.

À la suite des études décrites ci-dessus, la majorité des travailleurs ont conclu que, bien que le THC contenu réel, et peut-être mineur teneur en cannabinoïdes, peuvent être sous le contrôle de l'environnement, les rapports des principaux cannabinoïdes CDB et le THC et l'absence de l'ancien dans certains Cannabissamples [1] ont été contrôlés par le matériel génétique dans les semences. Cependant, il y avait un besoin pour les essais portant sur plusieurs générations de plus en plus avant de cette opinion a pu être confirmé [11].

Bien que l'origine géographique des semences a été connue dans la plupart des études décrites, en aucun cas eu le matériau de base (telle que produite avant l'exportation) été analysé de manière adéquate afin que les changements (le cas échéant) produites par les semences de plus en plus dans un environnement totalement étranger pourrait être respectées. Il a donc été considéré à la fois nécessaire et utile de cultiver des plantes à partir de semences dont l'origine est connue et dont le parent chimie pourrait être étudiée en détail.

Le Laboratoire de l'analyste du gouvernement a eu la chance de posséder un grand nombre d'échantillons de cannabis d'origine connue contenant des graines fertiles qui ont été utilisés comme base pour une étude de cannabis cultivé au Royaume-Uni.

Expérimentale

La sélection des semences

Les graines ont été prises à partir d'échantillons de cannabis importé illicitement d'origine connue. Le pays d'origine a été attribuée en prenant en compte les informations du transporteur, du bureau des douanes de Sa Majesté et de l'accise et de la voie d'importation. Les échantillons de cannabis ont été choisis pour avoir particulièrement caractéristique modèles cannabinoïdes ou le contenu qui pourrait être facilement suivi par les générations ultérieures. Bien que l'homogénéité des semences au sein d'une saisie ne peut être totalement garantie, l'homogénéité des saisies en ce qui concerne motif cannabinoïdes fait une hypothèse raisonnable que les semences serait aussi homogène.

Les conditions de croissance

La première génération de plantes cultivées au Royaume-Uni des Affaires indiennes et originaires de Thaïlande ont été cultivées à l'intérieur dans une pièce mal éclairée et non chauffée en 1979. La deuxième génération des plantes ci-dessus, avec la première génération des autres énumérées dans le tableau 1 ont été

cultivés dans des serres dans le sud-est de l'Angleterre en 1980. Les serres ont été chauffé doucement en Octobre et Novembre. En ce qui concerne les conditions possibles pour la culture de chaque plante sont identiques que l'attention avait été attirée sur des facteurs tels que la taille de pot [24], les conditions de culture [25], l'intensité de la lumière [11], maturité de la plante [24] et d'autres facteurs environnementaux locaux. Dans la mesure où il a été possible, toutes les plantes de cette étude ont été cultivées dans des conditions identiques, afin que les différences observées entre le parent et l'échantillon de cannabis plantes frère pourrait être attribuée à des différences d'environnement entre le Royaume-Uni et les pays d'origine des les stocks de départ. Dans cette étude, les stocks de départ désigne le lot de graines provenant d'une importation en particulier du cannabis.

Les graines ont été plantées à la fin de Février et le début de Mars en 75 mm des pots remplis de compost (Levington de Fisons Limited, Levington, Ipswich, Suffolk, Angleterre).Les semis ont été transplantés à 200 mm des pots remplis de compost même au début d'avril. Depuis le début de Juillet jusqu'à la récolte, les plantes ont reçu un flux hebdomadaire liquide (Bio Plant Food, Pan Industries Limited Britannica, Britannica Chambre, Waltham Cross, Hertfordshire, Angleterre). Dès que la floraison a commencé, les plantes ont été séparées selon le sexe et ont été soigneusement pollinisation à la main pour veiller à ce que les deux parents de graines fertiles ont été de la même origine stocks de départ. Les plantes ont été récoltées à maturité, les dates sont indiquées dans le tableau 2, sauf pour ceux qui ont montré des signes de détresse précoce. Les dates d'échéance se divisaient en deux groupes, Juillet et Août, et Novembre. Les plantes issues de graines marocaines maturité beaucoup plus tôt que tous les autres. Il semblait y avoir peu de corrélation entre la longitude de la source végétale et la date d'échéance au Royaume-Uni. Nordal et Braenden [13] fait remarquer sur les variations dans la taille et la forme des plantes cultivées à partir de graines différentes en Norvège.

Nous avons également pu noter plusieurs consistances en apparence au sein de chaque pays ainsi que certaines différences notables. plantes marocaines ont été, dans l'ensemble, plus courte et plus touffue que les autres plantes, leur hauteur étant limitée par leur période de croissance à court avant l'échéance. plantes thaïlandaises étaient toujours plus haut tandis que les usines du Swaziland ont d'abord été plutôt une croissance lente. La centrale des tiges des plantes zambiens ont été très épais et aux tiges rouges ont été notable sur certaines plantes du Zimbabwe. Les plantes ont été récoltées et les feuilles et les parties florales des plantes ont été séparés des parties ligneuses des plantes et séché à l'air. Tout tiges restant importantes ont été retirés avant la pesée du produit de chaque plante. Les plantes femelles, en général, a donné un poids plus important du cannabis dans les pays, même si une plante indienne mâle qui n'a pas à échéance avant Novembre produit plus de cannabis que ses homologues de sexe féminin et masculin ou féminin qui a mûri beaucoup plus tôt. Les rendements du cannabis et le sexe des végétaux élevés jusqu'à l'échéance sont comptabilisés dans le tableau 2.

Analyse

Les échantillons à la fois du cannabis et que parent grandi depuis ses stocks de départ au Royaume-Uni ont été analysés par CCM [26], la chromatographie gaz-liquide (GLC) [27] et la chromatographie liquide haute performance (HPLC) [28]. Parent saisies de cannabis ont été analysés quantitativement à l'état frais, et tel qu'il est reçu, à l'exception que les grandes tiges et les tiges ont été enlevées avant l'étape d'extraction des analyses. Le Royaume-Uni cultivés échantillons ont été analysés après l'enlèvement de la plante comme décrit ci-dessus. TLC a fourni une méthode simple et rapide pour évaluer les proportions relatives des cannabinoïdes principaux dans chaque échantillon. Compte tenu de l'importance du motif de cannabinoïdes (par opposition à la teneur réelle) dans l'évaluation d'origine [[1], [27]], les données quantitatives ne peuvent compliquer le tableau.Cependant GLC a été utilisée pour déterminer «total» de THC (la quantité de THC avec son acide), et HPLC a été utilisée pour déterminer «réel» THC.


Le montant de THCA a ensuite été déterminée comme décrit précédemment [29]. Tous les échantillons ont été analysés à l'état frais (c.-à-lors de la saisie ou immédiatement après la récolte).

Résultats et discussion

Les produits au Royaume-Uni après la récolte ont été dans tous les cas vert ou jaune-vert des matériaux friables. Ce n'était pas dans certains cas différents (et sans le recul ne se distingue pas) du cannabis d'origine importée. Cependant, le matériel importé est généralement de couleur plus foncée et les échantillons à partir de laquelle les Indiens et les graines du Zimbabwe ont été choisis étaient très brun.

La plupart des cannabinoïdes étaient présents en tant que parent de leurs acides. TLC a indiqué que la majorité du Royaume-Uni échantillons ont été cultivés, au moins dans le profil de cannabinoïdes, très semblable à l'échantillon à partir duquel leurs graines ont été prises. Toutefois, 5 des 25 plantes récoltées montré très différents modèles de cannabinoïdes du cannabis parent de leurs échantillons, les résultats pour toutes les plantes sont répertoriées dans le tableau 2. Tous les groupes ont produit au moins une plante qui est semblable au matériau d'origine et toutes les plantes de l'Inde, la Zambie et du Zimbabwe ont été semblables à leurs parents. Bien que toutes les graines pour un pays donné est venu de la même crise de cannabis, il est possible que ces crises, même minime, ne sont pas homogènes. Cela pourrait expliquer les patrons observés au Sri Lanka Swaziland 2 et 2, le motif de cette dernière caractéristique étant de quelques échantillons de cannabis en Afrique du Sud [1]. Dans quatre des cinq usines qui ont été très différents de leurs parents, de la CDB sur la mère n'a pas eu lieu dans l'usine sœur ou vice versa.Dans le cas de l'Inde 5, la CDB n'a pas eu lieu dans l'une des plantes cultivées en 1979 au Royaume-Uni, ni dans le matériau d'origine importée.
Les données quantitatives. En règle générale, et comme prévu à partir des données TLC, HPLC modèles ont été similaires pour les plantes d'une source autre que les exceptions principales questions examinées ci-dessus. Les tableaux 1 et 2 d'enregistrer les données quantitatives pour le cannabis stocks de départ et le matériau du Royaume-Uni augmenté respectivement. Il est clair à partir de ces données que le cannabis de bonne qualité peuvent être produites dans le Royaume-Uni, un résultat conforme à celle de Fairbairn et Liebmann [11], en grande partie aussi bien que du matériel importé frais [27]. Si l'on considère que seulement 15% de toutes les saisies de produits du cannabis examinés dans ce laboratoire sont frais au moment de l'analyse [27], la qualité du cannabis Royaume-Uni devient beaucoup plus d'importance. Bien qu'il existe une grande similitude dans la quantité réelle de THC dans les plantes d'un même pays, il existe des variations assez larges. Ces plantes (Inde 5, Maroc 2 et au Sri Lanka 1, 3) qui contiennent de la CDB ont des quantités inférieures de THC que les autres plantes du même stock de départ. Il est intéressant de noter que les indiens et thaïlandais plantes de première génération avaient de faibles teneurs en THC (voir tableau 1) alors que les usines de deuxième génération ont beaucoup plus la teneur en THC. Il se peut que la faible teneur des plantes de première génération est le reflet des conditions froides et assez sombre en vertu de laquelle ces plantes ont été cultivées de première génération.

Une étude du rapport des THCA / THC dans les plantes récoltées ont montré que, en général, pour la matière au Royaume-Uni, cela avait une valeur beaucoup plus élevée que pour le matériel importé [29]. Au cours de tous les principaux fournisseurs de cannabis frais au Royaume-Uni en 1979 (64 examinés), la moyenne THCA / THC était de 2,4 (s = 2,2).Toutefois, pour les 22 échantillons cultivés au Royaume-Uni, ce ratio en moyenne 40 (s = 46). Mechoulam [30] a noté que le cannabis cultivé dans les pays nordiques possèdent peu ou pas de cannabinoïdes neutre, tandis que celle cultivée dans les pays tropicaux ou subtropicaux ont subi au moins une décarboxylation de l'usine. Mechoulam en outre estimé que la méthode de préparation illicite causé décarboxylation encore.

Conclusions

De ces études, il était clair que le cannabis au moins préparés à partir de la première génération de plantes cultivées au Royaume-Uni à partir de graines de cannabis importé pourrait porter une ressemblance physique au matériau d'origine. En outre, les modèles de cannabinoïdes de matériel végétal stocks de départ et de frères et sœurs ont été similaires dans la plupart des cas, bien qu'il y ait quelques exceptions notables. Le «total» la teneur en THC n'ont montré aucune tendance distincte, mais il ne fait aucun doute qu'il était possible de produire du cannabis de bonne qualité au Royaume-Uni. Le ratio THCA / THC était significativement plus élevée dans les échantillons de cannabis au Royaume-Uni que dans les échantillons importés: détermination de ce rapport pour les échantillons de provenance inconnue pourrait fournir à l'analyste une indication quant à savoir si un échantillon a été importé, mais il serait nécessaire d'étudier un éventail beaucoup plus large des plantes avant une telle généralisation pourrait être justifiée. des études de nouvelle génération, sont prises pour surveiller les changements progressifs dans les caractéristiques de la plante.


Références


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030 Mechoulam R., vol "Chimie Marijuana", Science,. 168, 1970, p. 1159-1166.

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Ho je met deux fois la même moi faut que je roule

je reviens .... ha y est roulage effectué on s'y remet !
Ps: si jamais des âmes charitables passe par là et repère des fautes simple a leur yeux(on est pas pressé hein)
vu que la traduction rapide n'est pas des meilleur, qu'il n'hésite pas a postez ou m'en faire part par mp merci !
Ca va elle est petite celle là
6ème fiche:

Cristallisation et préliminaires des études de diffraction des rayons X de polykétide synthase-1 (PKS-1) de Cannabis sativa.
C Taguchi , Taura F , T Tamada , Y Shoyama , Y Shoyama , H Tanaka , R Kuroki , S Morimoto .
Faculté des sciences pharmaceutiques, Université de Kyushu, au Japon.

Résumé
Polykétide synthase-1 (PKS-1) est un nouveau type III polykétide synthase qui catalyse la biosynthèse de l'acide lactone hexanoyle triacétique de Cannabis sativa (souche mexicaine).
PKS-1 a été surproduit dans Escherichia coli, purifié, et enfin cristallisé dans deux groupes différents espaces. Le cristal obtenu 0,1 M de tampon HEPES pH 7,5 contenant 0,2 M d'acétate de calcium et 20% (p / v) de polyéthylène glycol 3350 diffractée à 1,65 Une résolution et appartenait au groupe d'espace P1, avec des paramètres de la maille a, b = 54,3, = 59,3 , c = 62,6 A, alpha = 69, beta = 81, gamma = 80 degrés. Un autre cristal obtenu dans 0,1 M de tampon HEPES pH 7,5 contenant 0,2 M de chlorure de sodium et 20% (p / v) de polyéthylène glycol 3350 diffractée à 1,55 Une résolution et appartenait à groupe d'espace P2 (1) 2 (1) 2 (1), avec paramètres de la maille a, b = 54,3, = 110, c = 130 A. Ces données nous permettront de déterminer la structure cristalline du PKS-1.

Figure 1
biosynthèse PKS-1-catalysée de lactone de l'acide hexanoyle triacétique (HTAL).

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7ème Fiche:

Les études sur Hashish I. Isolement et identification des cannabinols et l'effet de certains facteurs

Résumé
Fractionnement des constituants haschisch ainsi que l'isolement de certains constituants à l'échelle préparative a été réalisée en utilisant plusieurs techniques physico-chimiques à savoir. solvant, et la colonne chromatographique sur couche mince méthodes de fractionnement. Six électeurs savoir.cannabidiolique acide, le cannabidiol, cannabinol, le tétrahydrocannabinol, cannabichromene et un faisceau composante positive (isomère cannabidiol) ont été isolés et identifiés à l'aide de techniques chromatographiques et spectrophotométrie dans l'ultraviolet. Séparation des constituants haschisch ont également été réalisés par chromatographie en phase gazeuse-liquide. L'effet de certains facteurs à savoir.gel de silice, de l'acidité et l'alcalinité a été étudiée révèle un changement remarquable.
Die Trennung von Haschisch Bestandteilen sowie ihre Isolierung durch physikalischchemische Methoden zB Lösungsmittel Verteilung, Säulen-und wurde untersucht Dünnschicht-Chromatographie. Sechs Komponenten: Cannabidiolsäure, le cannabidiol, cannabinol, le tétrahydrocannabinol, cannabichromène und eine Komponente positive Beam (isomère cannabidiol) wurden durch und getrennt Chromatographie und UV-spectrophotométrie nachgewiesen. Die Trennung der Haschisch-Komponenten gelang durch auch GLC. Der Einfluss einiger Faktoren wie gel de silice, Säure und wurde studiert Alkali.
La séparation des constituants du haschich et de l'Isolement de certains constituants method UNE nominale préparative une Été effectué Exécuter la médical Court techniques physicochimiques savoir. au séparation du solvant, chromatographie sur colmne et sur Couche mince. Six électeurs savoir. acide cannabidiolique, le cannabidiol, cannabinol, le tétrahydrocannabinol, cannabichromene et non product Positif au Réactif de Béarn (isomère du cannabidiol) were Isolé et Identifié selon les Résultats obtenus par chromatographie et par ultra-violette Decomposition. La séparation des constituants du haschich une also Été nominale effectué la chromatographie liquide à gaz. L'effet de certains Facteurs savoir. le gel de silice, l'acidité et basicité la were étudié Revelant Changement des Nations Unies Assez notoire.

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8ème Fiche:

L'induction de fleurs mâles fertiles en plantes génétiquement Homme Cannabis sativa par nitrate d'argent et de thiosulfate d'argent complexe anionique

Ram Mohan HY et R. Département Sett de botanique, Université de Delhi, New Delhi (Inde)

Résumé

application apicale de nitrate d'argent (AgNO3; 50 et 100 ~ mikrog par plante) et de l'argent complexes thiosulfate anionique (STS, 25, 50 et 100 ~ mikrog par plante) pour les plantes femelles du Cannabis sativa a induit la formation d'une réduction de sexe masculin, intersexuels et entièrement modifié fleurs mâles à la nouvelle ramifications primaires (PLB), 10 ~ mikrog par plante de AgNO3 était inefficace et 150 traitement mikrog ~ prouvé inhibitrice. Un nombre maximum de totalement modifié fleurs mâles ont été formés en réponse à 100 ~ STS mikrog. Les fleurs mâles induite produit des grains de pollen qui ont germé sur les stigmates et les semences effectué ensemble. ions d'argent appliquée que STS a été plus efficace que AgNO3 dans l'induction des fleurs de modification du sex. L'induction de fleurs mâles sur des plantes femelles démontré dans ce travail est utile pour produire des graines qui donnent lieu à seules les plantes femelles.Cette technique est également utile pour le maintien de lignes gynoïques.

Mots clés: cannab & sativa, l'expression du sexe, de nitrate d'argent, argent complexes anioniques de thiosulfate

Introduction

Sex expression dans les plantes à fleurs est régulée par des facteurs génétiques, environnementaux et hormonaux. Il est prouvé que les hormones endogènes spécifiques jouent un rôle important dans le maintien du sexe génétique, et que le sexe peut être modifié par la croissance exogène les autorités de réglementation, en particulier dans les systèmes sexuellement polymorphes (Heslop-Harrison 1964). En général gibbérellines favoriser l'expression du sexe masculin et de l'auxine, l'éthylène et cytokinines promouvoir l'expression du sexe dans les différents systèmes monoïques et dioïques (Mohan Ram 1980). Les traitements qui réduisent le niveau d'éthylène dans les tissus (conditions hypo-Baric, le traitement par benzothiodiazole) ou antagoniser l'action de l'éthylène (CO2) provoquent la formation de fleurs mâles ou bisexuels à la place des femmes (Byers et al. 1972).
Récemment ions d'argent a été montré à interférer avec l'action d'éthylène, probablement sur les sites de récepteur de l'éthylène (Beyer 1976a). Après le rapport de Beyer (1976b) que l'application de nitrate d'argent (Agnos) initie la formation de fleurs mâles dans les concombres-bre gynoïques, il a été montré récemment dans quatre lignes de concombre que l'ion argent est supérieure à GA3 pour la fleur mâle induction-tion ( Kalloo 1978; Tolla et Peterson, 1979). Dans la ligne de 240 pistillées de Ricinus communis (Ankineedu et Rao 1973) une injection de solution internodale nitrate d'argent aqueuse induite fleurs mâles fertiles sur le plan strictement grappe terminale pistillées primaire (Mohan Ram et Sett 1980). Utilisation d'argent marqués (110 Ag m), Veen et Van de Geijn (1978) a montré que l'argent demandé que l'argent complexe anionique thiosulfate (STS) est transporté plus rapidement (2 mh-l) de AgNO3 (3 jours cm -1) et qu'il neutralise complètement l'effet de l'éthylène et sig-ficative s'étend le vase de la vie des œillets (Veen 1979).

Un rapport préliminaire de ce laboratoire ont montré que l'application apical de nitrate d'argent (100 mikrog ~ / plante) induit fleurs mâles fertiles dans les plantes de cannabis femelle (Sarath et Mohan Ram 1979). L'enquête présente-tion a été entrepris avec l'objectif d'établir la dose minimale et optimale de AgNO ~ nécessaires pour modifier l'expression du sexe des plantes femelles du Cannabis sativa et aussi pour savoir si les actes STS comme un antagoniste d'éthylène dans l'induction de sexe masculin.


Matériel et Méthodes

Les jeunes plants de Cannabis sativa croissant naturellement dans les Botani-cal Jardin du Ministère ont été transplantés au 3 - ou stade 4 feuilles à 25 cm des pots de terre remplis de terre large jardin, en Novembre, 1980. Le sexe des plantes a été déterminée après l'initiation florale.Seules les plantes femelles ont été choisies pour cette étude. Ces plantes ont une paire de fleurs femelles sessiles à la
base de chaque feuille. Chaque fleur femelle porte un en forme de bateau, vert, bractée glandulaires perigynous. A l'intérieur se trouve la bractée l'ovaire, dont la base est partiellement entouré par une cupule comme du papier. Le style est très réduite et porte deux stigmates allongés inégale papilles (Fig. 1 a encadré). En revanche, les fleurs mâles (sur les plantes mâles) sont portés en grappes (15-17 fleurs à chaque noeud) et à sa charge cinq tépales et cinq étamines.
Soit une solution aqueuse de AgNO ~ ou d'argent thiosulfate-phosphate complexe anionique [Ag (S20 ~)~-; (STS), 1 de nitrate d'argent (AgNO3), 8 thiosulfate de sodium (Na2S203) w / w] a été appliqué à la culture tirer la pointe des plantes femelles avec l'aide d'un
0,01 ml pipette. Tween-80 (0,01%) a été utilisé comme tensio-actif. Une baisse de 10 vtl du composé test a été appliqué chaque jour pendant 5 jours pour rattraper le montant total. Dix usines ont été maintenue pour chaque traitement. Les plantes avaient reçu 50, 100, 150 ~ mikrog / plante de AgNO3 ou 25, 50, 100 ~ mikrog / plante de la mission STS chacune, d'ici la fin de la cinquième journée. Les plants témoins ont reçu la solution de tensioactif seulement. La viabilité des grains de pollen a été testée, soit par immersion du pollen dans les 2 à 2,3,5-triphényl tétrazolium chlorure de H-(TTC; nutritionnelle biochimiques Corpo-ration, Cleveland, Ohio, USA) pour les 3 à 5 min ou par la germination fraîchement prélevé le pollen des fleurs mâles induite dans un milieu constitué de 7% de saccharose et 1% d'agar.


Résultats

En réponse à la 50 et 100 ~ traitements mikrog, les jeunes feuilles couvrant le sommet de la pousse est devenu noir (après le dernier traitement), donnant un aspect brûlé. croissance apicale a été suspendue et l'extrémité des pousses a repris son activité 20-25 jours après le dernier traitement. L'in-crément de hauteur constatée 48 jours après le traitement, n'ont montré aucune différence marquée par rapport à celle des témoins (tableau 1). Le nombre de nœuds a été signifi-significativement plus élevée dans les plantes traitées (tableau 1). Le ca-temps d'un arrêt temporaire de la croissance du méristème dans les deux ci-dessus traitements, dominance apicale a été libéré et les branches primaires latérales (BLP) de forme allongée, dépassant la longueur de celles présentes dans les plantes témoins (Fig. 1 a). Ces branches alésage fleurs du sexe types suivants: (?) (I) les femelles; (ii) intersexuelles (. 8; fleurs portant à la fois des organes masculins et féminins figure ld); (iii) la réduction de sexe masculin (Rg; fleurs à quatre ou moins étamines, Fig 1 e) et (iv) de sexe masculin (g;.. portant 5 étamines avec une grande quantité de grains de pollen, la figure 1 f). Figure 1 b montre une excisée PLB du traitement 100 mikrog ~, dans laquelle induit fleurs mâles sont vus. Un minimum de huit fleurs BLP nouvellement formé gisement de modification du sex-étaient présents dans toutes les plantes traitées. Les données recueillies à partir de ceux-ci ont été présentés dans le tableau 1. Il ya eu un changement notable dans le sexe des fleurs apparaissant sur l'axe principal après le traitement, mais en vue du plus grand nombre de fleurs formées sur la BLP, les données ont été recueillies auprès de ces. Le nombre total de fleurs formées sur chaque PLB était plus élevée dans les plantes traitées que chez les témoins. Ce fut à cause de la longueur supérieure de la BLP sur les plants traités et aussi en raison du nombre élevé de fleurs par nœud (par rapport à la nom-bre restreint de fleurs femelles à chaque noeud sur les plantes de contrôle). De façon surprenante, à la fois les traitements un accrois-sement de la proportion de fleurs portant une modification du sex (sur le nombre total de fleurs) a été remarqué de la position 1 à 8 de la BLP (de bas en haut), (tableau 1).







L'extrémité de la pousse est devenu noir, complètement asséché et a omis de faire revivre en réponse à la plus grande quantité de AgNO3 appliquée (150 ~ mikrog par plante). L'incre-ment peu de hauteur qui a eu lieu a été due à l'allongement internodale (tableau 1). Les jeunes feuilles déjà présent est devenu jaune et abscissées sans expansion. La suppression ramifications primaires qui se posent sur les nœuds inférieurs de l'axe principal est devenu très stimulé et provoqué les plantes à devenir touffue. Étonnamment, ces branches ne portait que quelques fleurs femelles avortées.

Dans une autre expérience, on a constaté que 10 AgNO3 mikrog ~ a été inefficace dans la modification de l'expression du sexe et de traitement 25 ~ mikrog causé seuls les trois premiers BLP nouvellement formé (de bas en haut) à supporter un nombre maximum de fleurs de modification du sex avec des fleurs femelles normales . Toutefois, le pourcentage de fleurs portant modification du sex-le long de chaque PLB dans les plantes traitées avec 25 ~ mikrog était inférieur à celui formé dans 50 ~ mikrog traitement.
Trois montants de la mission STS, à savoir 25, 50 et 100 ~ mikrog par plante, ont été sélectionnés sur la base des précédents ex-périence avec AgNO ~. L'extrémité des pousses des plantes traitées est devenu noir et semblait sèche en réponse à tous les trois doses de STS. Les jeunes feuilles présents au moment du traitement est devenu décoloré et leurs formes radicalement changé à l'échéance. La superficie moyenne des feuilles de contrôle, 25, 50 et 100 ~ traitements ont été mikrog 30,12, 14,46, 9,64 et 6,02 cm 2, respectivement. L'extrémité de la pousse a repris sa croissance 20-25 jours après le traitement avec 25 et 50 ~ STS mikrog, tandis que lorsqu'ils sont traités avec 100 mikrog ~, il n'a pas pu récupérer. Les nouvelles feuilles formées dans les deux premiers traitements ont aussi été petits et déformés. Le traitement avec 25 mikrog ~ de la mission STS n'a causé qu'une stimulation marginal en hauteur, bien que le numéro de noeud a été presque doublé (tableau 2). Dans les usines qui ont reçu 50 mikrog ~ du composé, la hauteur était significativement inférieure à celle de la commande, même si le numéro de noeud est resté inchangé. En réponse à 100 mikrog ~ de la mission STS, l'extrémité des pousses cessé de se développer et la petite augmentation de la hauteur est entièrement le résultat de l'élongation internodale (Tableau 2). On peut en déduire que l'élongation des cellules a été plus durement touchée que la division cellulaire en réponse à 25 et 50 mikrog ~ par plante. Dans ces traitements, les noeuds supérieurs produit BLP avec des fleurs de modification du sex (tableau 2). Les données présentées dans le tableau 2 concernent les huit premiers BLP formé après le traitement, car un nombre maximum de fleurs portant modification du sex étaient présents sur eux. Bien que la longueur de ces branches n'était pas significativement différente de celle des témoins, le nombre total de fleurs par branche dans les plantes traitées était plus élevé, résultant en une agrégation des fleurs au niveau des noeuds. Dans le traitement avec 50 mikrog ~, le nombre de fleurs femelles formées sur chaque PLB était moins et le pourcentage de fleurs modifié a été plus que celui formé en réponse à 25 mikrog ~. Dans les installations recevant 100 mikrog ~, les trois premiers noeuds (qui n'avait pas de BLP au moment du traitement) mis hors BLP très allongé qui portait un grand nombre de fleurs de modification du sex avec quelques fleurs femelles (Tableau 2). Fait intéressant, le nombre de fleurs mâles entièrement modifiée a été significativement supérieure à celle des hommes réduits, intersexuels et des fleurs femelles. En outre, dans chaque branche le nombre de fleurs modifié a été plus élevée dans les nœuds supérieurs, ce qui entraîne le regroupement des fleurs mâles vers le sommet. Le pourcentage de fleurs modifié par rapport au nombre total de fleurs présentes sur chaque branche était beaucoup plus élevé dans les 100 ~ mikrog (Fig. 1 c) de traitement que dans le 25 et 50 9g traitements.
Indépendamment de l'ampleur de la masculinisation (qu'il s'agisse d'hommes, réduits condition masculine ou intersexués) causés par un traitement à l'AgNO3 ou STS, les anthères dans les fleurs de modification du sex contenait une grande quantité de grains de pollen viable constatée par le test au tétrazolium. Les grains de pollen viable également ger-nels dans une demi-heure d'incubation dans un milieu agar-saccharose (Fig. 1 g). Pour tester la capacité de pollen pour la germination et pour effectuer des graines, les stigmates des fleurs femelles non pollinisées ont été fécondées avec le pollen des fleurs mâles et induit en sacs. Les fleurs femelles handpollinated développés ensemencées fruits, tandis que ceux qui restent non pollinisés et sacs omis de le faire et abscission. Ainsi, le pollen des fleurs mâles induite étaient capables d'induire la formation des graines. Sur la base de nos expériences précédentes (Jaiswal 1972) nous supposons que la descendance de ces semences serait de 100% pistil-fin, bien que dans cette expérience particulière le sexe des plantes n'a pas été marqué.

Discussion

La présente enquête a corroboré les travaux antérieurs réalisés dans ce laboratoire par Sarath et Mohan Ram (1979) et a établi que l'application apicale de AgNO3 à des plantes femelles du Cannabis stimule le développement des fleurs mâles. En outre, les expériences ont montré que 50 et 100 ~ montants mikrog de AgNO3 sont les plus efficaces dans l'induction de fleurs mâles fertiles au niveau des noeuds nouvellement formé sur l'axe principal et sur le BLP fraîchement formé. Le traitement avec
10 fig avérées inefficaces que l'application de 150 mikrog ~ fortement inhibé la croissance des méristèmes apicaux et latéraux.
ions d'argent AgNO3 appliqué comme l'a montré Beyer (1976a) pour bloquer l'action ou l'éthylène appliqué de manière exogène. Il a démontré ce phénomène dans le classique «triple», la réponse (qui comprenait un retard de croissance, croissance de la tige horizontale et gonflement) dans les pois intacts étiolée ;. en feuilles, fleurs et abscission en coton, et dans la sénescence des Cattleya Dans une usine de concombre gynoïques, AgNO ~ effectivement changé l'expression du sexe de femme à homme (Beyer 1976b) Intersexuels et fleurs mâles ont été induites par le traitement de AgNO3. d'autres lignes de concombre gynoïques par Kalloo (1978), et Atsmon Tabbak (1979) et Tolla et Peterson (1979). Curieusement dans un concombre monoïques, AgNO3 annulé l'effet des contraintes mécaniques et induit la production de fleurs pistillées (Taka-hashi et Suge 1980) .
Le présent travail a également montré que STS est plus efficace que AgNO3 dans l'induction de fleurs mâles sur des plantes femelles. Le nombre de fleurs mâles induite par plante et le pourcentage de fleurs de modification du sex-le long de chaque PLB étaient plus élevés dans le traitement de STS. STS a agi contre-effet d'éthylène dans les œillets et étendu leur vase de vie de manière significative (Veen 1979). Dans la même usine, un traitement d'impulsion de 10 minutes avec STS (0,1 mM Ag) a doublé le vase de la vie des fleurs (Reid et al. 1980). Dimalla et Van Staden (1980) ont également prouvé que, la durée de conservation des oeillets peut être augmenté de façon spectaculaire en plongeant l'extrémité coupée en STS pour 10 min. La présente étude a indiqué que applica-tion de l'argent dans le complexe anionique est plus efficace que celle de la forme cationique. En outre, la présente enquête a clairement démontré que STS déclenche également l'expression du sexe mâle chez les plantes femelles du Can-nabis sativa probablement en bloquant l'action de l'éthyl-ène. Induction chimique de fleurs mâles est donc un moyen de produire des plantes femelles ou garantie du maintien gynoïques lignes à travers la production de semences suivantes autofécondation chez les plantes femelles. Si elle est correctement exploitée, cette technique devrait être très enrichissante dans les programmes d'amélioration des cultures.


Littérature

Ankineedu, G.; Rao, NGP (1973): Développement de ricin pistillées. Indian J. Genet. Plant Breed. 33, 416-422
Atsmon, D.; Tabbak, C. (1979): Effets comparatifs de gib-berellin, nitrate d'argent et de la glycine sur la tendance sexuelle aminoéthoxyvinyl et l'évolution d'éthylène dans la plante de concombre (Cucumis sativus L.). Plant Cell Physiol. 20, 1547-1556
Beyer, EM (1976 a): un puissant inhibiteur de l'éthylène chez les plantes. Plant Physiol. 58, 268-271 Beyer, EM (1976b): ions d'argent: Un agent antiethylene puissant dans le concombre et la tomate. HortScience 11, 195-196
Byers, RE; Baker, LR; Vendre, HM; Herner, RC; Dilley, D. (1972): éthylène: un régulateur naturel de l'expression du sexe de Cucumis melo L. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69, 717-720
Ram Mohan HY et Sett R.: Induction de fleurs mâles des plantes génétiquement Cannabis Homme
Dimalla, GG; Van Staden, J. (1980): L'effet de conservation thio-sulfate d'argent sur la physiologie de la coupe œillets Influence I. sur la longévité et l'état de glucides. Z. Pflan - zenphysiol. 99, 9-17
Heslop-Harrison, J. (1964): expression du sexe des plantes à fleurs. Brookhaven Symp. Biol. 16, 109-122
Jaiswal, VS (1972):. Effet de quelques régulateurs de croissance sur la croissance de vulgarisation et l'expression du sexe de Cannabis sativa L. Ph D. Thèse présentée à l'Université de Delhi, Delhi, Inde
Kalloo, S. (1978): l'induction chimique de fleurs mâles en quatre lignes déterminée gynoïques de décapage de concombre. Gartenbau 43, 280-282
Mohan Ram, HY (1980): Hormones et le sexe des fleurs. Plant Biochem. JSM Volume Memorial Sircar, p. 77-88
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Reid, MS; Paul, JL; Farhoomand, MB; Kofranek, AM; Staby, GL (1980): le traitement d'impulsions avec des complexes thiosulfate-phate d'argent prolonge la vie du vase d'œillets coupés. J. Am. Soc. Hort. Sci. 105, 25-27
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Takahashi, H.; Suge, H. (1980): expression du sexe dans les plants de concombre comme touchés par le stress mécanique. Plant Cell Physiol. 21, 303-310
Tolla, GE; Peterson, GE (1979): Comparaison de la gibbérelline A4/A7 et de nitrate d'argent pour l'induction de fleurs mâles en ligne concombre gynoïques. HortScience 14, 542-544
Effets de l'argent sur la synthèse d'éthylène et d'action en oeillets coupés: Veen, H. (1979). Planta 145, 467-470
Veen, H.; van de Geijn, SC (1978): les formes de mobilité ionique et de l'argent comme liés à la longévité des oeillets coupés. Planta 140, 93-96
Reçu le 15 novembre, 1981 admis 1 Février, 1982 Communiqué par D. von Wcttstein
Ram Mohan Dr. Dr. R. Département HY Sett de botanique Université de Delhi Delhi-110007 (Inde]

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9ème Fiche:

Cannabidiol, extrait de Cannabis sativa, inhibe sélectivement hypermotilité inflammatoire chez les souris.
R Capasso , Borrelli F , G Aviello , Romano B , C Scalisi , Capasso F , AA Izzo .
Département de pharmacologie expérimentale, Université de Naples Federico II et Groupe de recherche endocannabinoïde, Naples, Italie.

Résumé
CONTEXTE ET OBJECTIF: le cannabidiol est un dérivé non-psychotropes du cannabis composé qui exerce une pléthore d'actions pharmacologiques, y compris les anti-inflammatoires et anti-tumorale des effets neuroprotecteurs, avec un intérêt thérapeutique potentiel. Toutefois, les actions du cannabidiol dans le tube digestif sont en grande partie inexploré. Dans la présente étude, nous avons étudié l'effet du cannabidiol sur la motilité intestinale normale (contrôle) des souris et chez la souris à l'inflammation intestinale.
Approche expérimentale: la motilité in vivo a été mesurée en évaluant la distribution d'un marqueur fluorescent administré par voie orale ainsi que l'intestin grêle; inflammation intestinale a été induite par l'huile de croton irritant; contractilité in vitro a été évaluée en stimulant l'iléon isolé, dans un bain d'organe, avec ACh.
PRINCIPAUX RÉSULTATS: In vivo, le cannabidiol n'a pas affecté la motilité chez les souris témoins, mais l'huile de croton normalisée hypermotilité induite. L'effet inhibiteur du cannabidiol a été contrecarrée par l'antagoniste du récepteur CB1 des cannabinoïdes rimonabant, mais pas par l'antagoniste du récepteur CB2 SR144528 cannabinoïdes (N-[-1S-endo-1 ,3,3-triméthyl bicyclo [2.2.1] heptane-2- yl] -5 - (4-chloro-3-méthylphényl) -1 - (4-méthylbenzyl)-pyrazole-3-carboxamide), par la naloxone, un antagoniste des récepteurs opioïdes ou par l'antagoniste adrénergique yohimbine-alpha2. Cannabidiol n'a pas réduit la motilité chez les animaux traités avec le amide hydrolase acide gras (FAAH) inhibiteur de la N-arachidonoyl-5-hydroxytryptamine, alors que le lopéramide était encore en vigueur. In vitro, le cannabidiol inhibe les contractions induites par ACh dans l'iléon isolé à la fois de contrôle et traité à l'huile de croton souris.
CONCLUSIONS ET IMPLICATIONS: le cannabidiol réduit de manière sélective l'huile de croton-hypermotilité induite chez la souris in vivo, et cet effet implique récepteurs de cannabinoïdes CB1 et FAAH. Compte tenu de sa faible toxicité chez l'homme, le cannabidiol peut représenter un bon candidat pour normaliser la motilité chez les patients atteints de la maladie inflammatoire de l'intestin.

Figure 1
Effet inhibiteur du cannabidiol (CBD, 1-10 mg kg -1 , ip) sur le transit intestinal dans l'huile de croton-souris traitées in vivo . Transit a été exprimée par le centre géométrique (GC) de la distribution d'un marqueur fluorescent long de l'intestin grêle. GC allait de 1 (motilité minimum) à 10 (motilité maximale) (voir la section Méthodes). Les barres représentent les moyennes ± semean de 8-10 animaux pour chaque groupe expérimental. # P <0,05 vs contrôle et * P <0,05 vs l'huile de croton.

Figure 2
souris Croton traité à l'huile: l'effet du cannabidiol ip-injecté (CDB, 5 mg kg -1 ) et le lopéramide (LOP, 0,075 mg kg -1 ) (seul ou en présence du cannabinoïde CB 1 rimonabant antagoniste du récepteur (0,1 mg kg -1 , ip)) sur le transit intestinal in vivo . Transit a été exprimée par le centre géométrique (GC) de la distribution d'un marqueur fluorescent long de l'intestin grêle. GC allait de 1 (motilité minimum) à 10 (motilité maximale) (voir la section Méthodes). Les barres représentent les moyennes ± semean de 8-10 animaux. # P <0,05 vs contrôle, * P <0,05 vs huile de croton et ° P <0,05 vs CDB.

Figure 3
souris Croton traité à l'huile: l'effet du cannabidiol ip-injecté (CDB, 5 mg kg -1 ) et l'amide hydrolase acide gras inhibiteur de N -arachidonoyl-5-hydroxytryptamine (AA-5-HT, 7,5 mg kg -1 ) (seul ou en association) sur le transit intestinal in vivo . Transit a été exprimée par le centre géométrique (GC) de la distribution d'un marqueur fluorescent long de l'intestin grêle. GC allait de 1 (motilité minimum) à 10 (motilité maximale) (voir la section Méthodes). Les barres représentent les moyennes ± semean de 8-10 animaux. # P <0,05 vs contrôle, * P <0,05 et ** P <0,05 vs huile de croton et ° P <0,05 vs LOP.

Figure 4
Effet inhibiteur du cannabidiol (0,01 à 100 μ M ) sur les contractions induites par ACh (1 μ M ) dans l'iléon isolé de la souris et l'huile de croton-traité les souris témoins. Chaque point représente la moyenne ± semean de 7-8 expériences.

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10ème Fiche:

Phytochimiques et les analyses génétiques de cannabis ancienne de l'Asie centrale

Résumé

Les tombes Yanghai près de Turpan, Xinjiang-Ouïgour région, la Chine ont récemment été fouillés à révéler la tombe 2700-année-vieux d'un chaman caucasoïde dont les attributs inclus une importante cache de cannabis, superbement conservés par les conditions climatiques et à l'inhumation. Une équipe pluridisciplinaire internationale a montré par l'examen botanique, investigation phytochimique, et l'analyse génétique d'acide désoxyribonucléique, par réaction de polymérisation en chaîne que ce matériau contient tétrahydrocannabinol, le composant psychoactif du cannabis, son produit de dégradation oxydative, cannabinol, d'autres métabolites, et de son enzyme de synthèse, l'acide tetrahydrocannabinolic synthase, ainsi que d'un nouveau variant génétique avec deux polymorphismes de nucléotides simples. Le cannabis a été censé être employé par la présente la culture comme un agent de médicaments ou de psychotropes, ou une aide à la divination. À notre connaissance, ces enquêtes fournissent la documentation la plus ancienne du cannabis comme un agent pharmacologiquement active, et de contribuer au dossier médical et archéologiques de cette culture pré-Route de la Soie.
La suite plus tard y'a déjà pas mal

Introduction

agriculteurs ouïghoure cultiver la terre à la base de la Shan Huoyan («Monts Flamboyants»), dans le désert de Gobi près de Turpan, Xinjiang-Ouïgour région, la Chine il ya 20 ans a découvert un vaste cimetière antique (54 000 m2) qui correspond apparemment à la proximité Aidinghu, Alagou, et les fouilles Subeixi (Ma et Wang, 1994; Chen et Hiebert, 1995; Davis-Kimball, 1998; Kamberi, 1998; An, 2008) (voir Fig supplémentaire au S1 en ligne JXB.) attribuée à la Gushi culture (plus tard rendu Jushi, ou Cheshi) (Academia Turfanica, 2006). Les premiers rapports écrits concernant ce clan, rédigé vers 2000 ans BP (before present) dans le dossier historique chinoise, Hou Hanshu, décrit nomades blond aux yeux bleus de race blanche parlant une langue indo-européenne (probablement une forme de tokharien, un disparu langue indo-européenne liée à la musique celtique, Italic et Anatolic (Ma et Sun, 1994). Gushi tendance chevaux et les animaux au pâturage, cultivaient la terre et ont été achevées archers (Mallory et Mair, 2000). Le site est situé dans le Eurasie (Fig. 1A, B), 2500 km de toute mer et situé dans le bassin du lac Ayding, place le deuxième plus bas sur Terre après la Mer Morte (Fig. 1A, B). fouilles formelle achevée en 2003 a révélé quelque 2500 tombes . datant de 3200-2000 ans BP (Xinjiang Institut des reliques culturelles et de l'archéologie, 2004) D'autres preuves d'outils en pierre taillée et d'autres éléments indiquent une possible présence de l'homme dans la région depuis près de 10 000 à 40 000 ans (Kamberi, 1998; Academia Turfanica, 2006). Grâce à une combinaison de tombes profonde (2 m ou plus), un climat extrêmement aride (16 mm de précipitations annuelles), et les conditions de sol alcalin (pH 8.6 au 9.1 (Pan, 1996), la préservation remarquable de la des restes humains a abouti à la momification de nombreux organismes sans un besoin de méthodes chimiques. nombreux objets provenant des tombes inclus équipement équestre et de nombreuses cultures de l'Ouest Asie tels que Capparis spinosa L. (câpres) (Jiang et al., 2007), Triticum spp. (blé), Hordeum spp. (orge nue), et Vitis vinifera L. (vignes) (Jiang, 2008), souvent des siècles avant leur première description dans l'Est de la Chine (Puett, 1998).

Fig. 1.

Les cartes des zones. (A) Plan de Turpan, Xinjiang, en Chine et sa situation en Asie centrale. (B) Carte des tombes Yanghai site et les environs (adapté du Xinjiang Institut des reliques culturelles et de l'archéologie, 2004).

Une tombe, M90 (coordonnées GPS: 42 ° 48,395 'N, 89 ° 38,958' E; altitude, 58 m) (voir Fig supplémentaire S2A, B à JXB en ligne.), Contenait le squelette d'un homme de statut social élevé de un âge estimé de 45 ans, dont les attributs inclus brides, équipement de tir, une harpe Kongou, et autres pièces justificatives de son identité comme un chaman (voir figures complémentaires S3A, B, C-4A à JXB en ligne). Sa sépulture comme un squelette désarticulé, par opposition à un corps momifié comme plus fréquemment a été trouvé, a suggéré qu'il est probablement mort dans les montagnes du Tian Shan («Monts Célestes», ou Tangri Tagh en ouïgour) (Fig. 1), et ses os ont plus tard été enterré à Yanghai, comme des tombeaux à proximité contenues gros madriers de Picea (épinette) spp. qui poussent à 3000 m d'altitude. Modern pasteurs ouïghoure suivre un chemin similaire migratoire annuel vers les pâturages d'été des 60-80 km loin de la tombe. Près de la tête et le pied du cercueil du chaman jeter un panier en cuir et grande écuelle de bois (voir Fig supplémentaire. S5A, B à JXB en ligne) rempli de 789 g de matière végétale, d'abord cru que Coriandrum sativum L. (coriandre), mais qui, après examen minutieux botanique, s'est avéré être Cannabis sativa L. (Jiang et al., 2006). Une datation au radiocarbone initial de 2500 ans BP a par la suite été corrigée à un chiffre calibré de 2700 ans BP sur la base des analyses supplémentaires des articles d 'équitation et la corrélation des données de cernes (dendrochronologie) en Chine. Si une publication antérieure (Jiang et al., 2006) a souligné les caractéristiques morphologiques d'identifier le cannabis, l'étude en cours utilisés supplémentaires botaniques, phytochimiques, des recherches génétiques et de démontrer que ce cannabis était psychoactives et probablement cultivé à des fins médicinales ou divinatoires. Un grand soin a été prise pour prévenir la contamination de l'échantillon pour les analyses.
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Matériels et méthodes
méthodes Photomicrographie

Lors de la livraison de courrier en provenance de Chine, un sac en polyéthylène contenant 11 g de cannabis ancienne a été stérilisé avec de l'éthanol, manipulée avec des gants de laboratoire dans une hotte à flux laminaire, et transférés avec une spatule métallique propre (Fig. 2A). Deux niveaux de la microscopie optique ont été utilisés dans cette étude. Pour les observations sur les akènes (Fig. 2D), une faible puissance Brunel microscope MX3 (Chippenham, Wiltshire, Royaume-Uni) a été utilisé et l'objectif 3 × utilisé en conjonction avec un appareil photo Olympus SP350 8 mégapixels, insert stéréo 30 mm tube de lentille, et photoniques PL2000 - double source de lumière froide bras. Grand grossissement était nécessaire pour des observations plus détaillées de trichomes (Fig. 2B, C): un microscope haute puissance stéréo léger avec une tête trinoculaire pour fixer l'appareil (STE Royaume-Uni, Sittingbourne, Kent, Royaume-Uni) avec un réticule de l'oculaire pour la mesure de la taille des spécimens équipé d'× 4, × 10 et × 40 objectifs. × 3 La capacité de l'appareil photo zoom optique fourni un grossissement supplémentaire.


Photomicrographies de cannabis ancienne. (A) Droits de l'ensemble de l'échantillon de cannabis d'être transféré dans une hotte à flux laminaire. (B) Microphotographie d'un fragment de feuille à faible puissance affichant non-glandulaires et de l'ambre sessiles trichomes glandulaires. Note de rétention de la couleur de la chlorophylle et vert, barre d'échelle = 100 um. (C) photomicrographie supérieur puissance d'un trichome glandulaire unique sessiles. Au moins 4 de ses 8 cellules sécrétrices sont clairement visibles sur la droite, et la cicatrice de l'attachement aux cellules stype dans le centre, barre d'échelle = 25 um. (D) photomicrographie de faible puissance d'un akène cannabis («graine»), y compris la base avec une cicatrice non-concave d'attachement visible, barre d'échelle = 1 mm.

Les observations sur les graines ont été effectuées sur des échantillons non montées. Pour ces derniers, de petits morceaux de tissus de la plante ont été placés directement sur la plaque microscope de faible puissance.Lors de l'utilisation du microscope à haute puissance, les échantillons ont été montés à sec sur une lame de verre. Pour obtenir des vues où une grande partie de la matière ont été simultanément mis au point, plat spécimens des échantillons (comme indiqué) a donné le plus grand succès.

Sur le microscope de faible puissance de l'échantillon de semences a été illuminée par la lumière incidente, en utilisant un PL2000 photonique - double bras "source de lumière froide (Fig. 2D). Certains échantillons, lorsqu'il est placé sur le microscope de forte puissance, ont été également mis en lumière en utilisant la source de lumière froide. D'autres ont été éclairée par en dessous. Lorsque les échantillons visualisation monté sous une lamelle, il est courant de mettre en place un microscope en utilisant la méthode éclairage de Köhler (Delly, 1988). Cela a permis que la lumière de la lentille du condenseur a été porté correctement sur la lame de microscope. Pour les spécimens mis au jour, la hauteur du condenseur et l'ouverture ont été ajustés en regardant le sujet jusqu'à ce que la résolution optimale a été obtenue. Dans tous les cas, les spécimens ont été mesurés à l'aide d'un réticule dans l'oculaire.

Pour permettre aux photographies à prendre à travers le microscope de faible puissance, un oculaire a été remplacé par un tube de 30 mm compatible objectif sur lequel les caméras reflex mono-objectif ou numérique serait attaché. Comme dans la photographie ordinaire, la profondeur de champ est considéré comme la distance entre la plaine objet le plus proche de la plaine objet le plus éloigné qui est en discussion. Lorsque les objets sont très loin de l'objectif de la caméra de la profondeur de champ est grande. Cependant, des diminutions de profondeur que l'image se rapproche de la lentille. Lorsque photomicrographies prendre, la profondeur de champ se mesure en microns (Delly, 1988). Pour maximiser les chances de trouver d'importantes zones de tissu en même temps au point au sein de cette faible profondeur de champ, plusieurs échantillons ont été portées le plus plat possible sur lames de verre. Dans tous les cas, les microphotographies ont été prises sur un banc solide et le déclencheur activé à distance afin de réduire manuellement induite par le tremblement de caméra.

En aucun cas, a été une technique de modification d'image utilisés dans ces photographies.
méthodes Phytochemistry

Environ 2 g de matériel végétal séché a été extrait avec 200 ml de méthanol: chloroforme (9:1 v / v) par sonication à température ambiante (21 ° C), la technique standard d'extraction pour ce laboratoire (GW Pharmaceuticals), une méthode qui recrute> 95% de la teneur en phytocannabinoid. La couche de solvant a ensuite été transférée à travers un filtre en papier dans un ballon d'évaporateur rotatif. Le ballon a été évaporée à sec à 40 ° C, sous pression réduite, avant la remise en suspension dans 4 ml de méthanol: dichlorométhane (3:1 v / v). Cet échantillon a été transféré à deux flacons pour échantillonneur automatique à être analysés par GC-FID-MS et HPLC-UV. À toutes les étapes, de la verrerie propre a été extraite avec les mêmes solvants pour s'assurer qu'aucun des pics observés serait une suite de la contamination. analyses GC-FID-MS ont été réalisées sur un chromatographe en phase gazeuse HP6890, couplée à un spectromètre de masse inerte 5975. Le système a été contrôlé avec Agilent MSD Chemstation D.03.00.611. La GC a été muni d'une colonne capillaire en silice fondue Zebron (30 m × 0,32 mm de diamètre interne) recouverte de ZB-5 à une épaisseur de 0,25 um (Phenomenex). La température du four a été programmé à partir de 70 ° C à 305 ° C à une vitesse de 5 ° C min-1. Le port de l'injecteur et la ligne de transfert ont été maintenues à 275 ° C et 300 ° C, respectivement. L'hélium a été utilisé comme gaz vecteur à une pression de 55 kPa. Le rapport de division d'injection était de 5:1. profils HPLC ont été obtenus en utilisant un Agilent série 1100 HPLC système contrôlé par un logiciel Chemstation version A09.03. profils Cannabinoid ont été générés en utilisant une colonne C18 (150 x 4,6 mm, 5 um) colonne analytique muni d'un C18 (10 x 4,6 mm, 5 um) colonne de garde. La phase mobile est constituée d'acétonitrile, 0,25% d'acide v / acétique et le méthanol à un débit de 1,0 ml min-1 et la colonne a été maintenue à 35 ° C. Les profils UV ont été enregistrés à 220 nm.
Les méthodes génétiques

ADN a été extrait à partir de feuilles séchées pulvérisé, à partir de deux semences appartenant probablement à spp cannabis., Et de trois graines probablement d'autres espèces non identifiées. Le DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) a été utilisé, selon le protocole Qiagen, mais avec quelques modifications pour augmenter la quantité finale d'ADN et d'éviter la contamination externe et artificielle. Pour cette raison, pré-PCR et les opérations post-PCR ont été physiquement séparées et exécutées dans des environnements différents. Ancienne extraction d'ADN et d'autres œuvres pré-PCR ont été effectuées en vertu d'un système de ventilation UV-filtrée et un flux d'air à pression positive. embouts de pipette filtré et tubes stériles et les plastiques ont toujours été utilisées, des gants, des masques et des blouses de laboratoire étaient toujours portés. La qualité de l'ADN obtenu a été estimée par le ratio d'absorbance A260/A280. Afin d'obtenir la plus haute fidélité possible lors de la synthèse PCR, réactions de PCR ont été réalisées avec le Maître Pwo prêt-à-utiliser relecture master mix (Roche Applied Science) en fonction de leur protocole. Les amorces conçues pour tester l'intégrité de l'ADN et l'aptitude à l'analyse par PCR et l'identification des espèces étaient de la région ITS de l'ADN ribosomal nucléaire (Blattner, 1999), et d'une région non codante de l'ADN des chloroplastes (Taberlet et al., 1991). Les mélanges réactionnels ont été soumis d'abord à une dénaturation thermique initial à 94 ° C pendant 3 min, puis ils ont été soumis à 35 cycles de dénaturation thermique à 94 ° C pendant 30 s, 1 min de l'amorce de recuit à 55 ° C pour les SES région, et 50 ° C pour ADNcp, et l'ADN d'extension à 72 ° C pendant 40 s. Enfin, les échantillons ont été maintenues à 72 ° C pendant 5 min pour la dernière prolongation. réactions PCR ont été réalisées dans un MJ Research PTC-100 thermocycleur (MJ Research, USA). Les produits d'amplification ont été séparés par électrophorèse dans un gel d'agarose 1,5%. Les bandes ont été excisées et purifié avec le kit MinElute Gel Extraction (Qiagen). Les produits de PCR purifiés ont été quantifiés et directement vers l'avant et arrière-séquence, en utilisant le GenomeLab ™ Dye Terminator Cycle Sequencing avec un Kit de démarrage rapide sur un analyseur de CEQ8000 génétiques (Beckman Coulter). Les séquences des amorces ont été identifiés et supprimés manuellement, et les recherches de base de données ont été réalisées avec l'algorithme BLASTN (Altschul et al., 1990). Les résultats des séquences prouvé que le tissu pulvérisé séché a été de Cannabis sativa L., en dépit de notre observation dans l'échantillon mélange de quelques petites graines de différentes espèces, retirés avant l'extraction de l'ADN; aucune différence n'a été observée entre les séquences obtenues et ceux qui sont déposés à la gène NCBI-bancaire (pour THCA et CBDA-synthases, numéros d'accession Genbank E55108/GI 18529739 et 18623981 E33091/GI). En revanche, aucune amplification a été obtenue à partir d'ADN extrait à partir des graines de cannabis et de l'autre, une espèce non identifiée. Le statut allélique à un seul locus, B, connu pour être le gène majeur déterminant la CDB / THC du cannabis (de Meijer et al., 2003), a été étudiée dans le matériel ancien. Les paires d'amorces décrites (de Meijer et al., 2003) ne sont pas suffisamment associés à la chémotype (Pacifico et al., 2006), et les amorces à base de séquences qui y sont décrites (Pacifico et al., 2006) n'a pas le rendement d'amplification , probablement à cause de l'intégrité limitée de l'ADN à partir de tissus anciens de cannabis, qui n'a pas subi l'amplification d'un fragment de 1100 Da ADN. Par conséquent, trois couples d'amorces différents (Fw150 × Rev328, Fw166 × Rev318, et Fw154 × Rev318) ont été utilisés. Ces amorces ont été conçues sur deux petites régions conservées d'une zone variant entre les séquences connues des allèles THC et du CBD. Lors d'un essai sur les tissus de cannabis frais, ces amorces ont été démontrées pour être en mesure d'amplifier les deux allèles (PCR et les séquences de données non présentées). En utilisant différentes combinaisons de paires d'amorces, le risque de non-match ou d'une incompatibilité en raison de mutations possibles dans l'extrémité 3 'de la région amorce a été surmonté. Les séquences des amorces sont répertoriés dans la figure supplémentaire. S8 à JXB en ligne. Tous les mélanges de réaction ont été soumis d'abord à la chaleur de dénaturation à 94 ° C pendant 3 min, puis à 35 cycles composés de dénaturation thermique à 94 ° C pendant 15 s, amorce un recuit à 54 ° C pendant 30 s, et extension de l'ADN à 72 ° C pendant 1 min. Enfin, les échantillons ont été maintenues à 72 ° C pendant 5 min pour la dernière prolongation de l'ADN. Les produits de PCR ont été séparés par électrophorèse dans un gel d'agarose 1,5%. Les bandes ont été excisées et purifié avec MinElute Gel Extraction kit (Qiagen). Les produits de PCR purifiés ont été quantifiés et directement séquencé en avant et en arrière, en utilisant le GenomeLab ™ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit de démarrage rapide avec un analyseur CEQ8000 génétiques (Beckman Coulter).
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Résultats
Analyse microscopique botanique

L'examen macroscopique de l'échantillon de 11 g de cannabis fourni par l'Académie chinoise des Sciences a révélé vrac sec matériel végétal (Fig. 2A). L'impression que le matériel végétal a été légèrement martelé a été appuyée par l'examen de la cuve en bois, dont la surface interne était usé, apparemment d'une utilisation comme un mortier (voir Fig supplémentaire. S5B à JXB en ligne). Le cannabis conservé une couleur étonnamment verte dans ses parties visibles et affichés feuilles trichomes glandulaires (Fig. 2B), l'usine phytochimique de la plante et du site de fabrication de cannabinoïdes et terpénoïdes (Potter, 2004; McPartland et Russo, 2001; Kim et Mahlberg , 2003). Toutefois, l'échantillon anciens n'avaient pas l'odeur caractéristique du cannabis. L'examen microscopique a confirmé la présence de trichomes intacts sessiles avec une teinte ambrée (Fig. 2B), tandis que de plus haute résolution documenté la rétention des cellules sécrétrices visible dans les trichomes (Fig. 2C). Akènes («graines») en moyenne 2.2 à 3.6 mm de longueur (Jiang et al., 2006), ont été de couleur claire avec quelques stries, mais montré bruts, l'attachement de fruits non-concave (Fig. 2D), tous les traits de la domestication ( Schlumbaum et al., 2008) associés à des souches cultivées de cannabis (Vavilov, 1926). En revanche, les akènes des souches sauvages sont habituellement plus petits et plus sombre avec des zones de fixation concave qui favorisent éclatement et la propagation facile (Vavilov, 1926). La germination a été tentée avec 100 akènes dans le compost, mais pas d'émergence a été observée après 21 d.
analyse phytochimique

équipes phytochimiques et génétiques ont d'abord été aveuglé à l'autre de résultats. L'extraction de 2 g de matériel végétal issu de 67,9 mg de solides après l'élimination des solvants. En utilisant la chromatographie liquide haute performance (HPLC), la plus haute crête cannabinoïdes a été cannabinol (CBN) à 7,4 min, mais les niveaux de concentration sont très faibles, en moyenne 0,007% w / w. CBN est un produit de dégradation oxydative de THC, produits non-enzymatique, augmente avec l'âge (Brenneisen, 2007). Il y avait aussi des pics correspondant aux temps de rétention prévu pour le cannabidiol (CBD) à 4,9 min et cannabichromene (CBC) à 12 min (Fig.3).Les deux sont phytocannabinoïdes résultant de voies alternatives enzymatique que THC rendement (de Meijer et al., 2003). Il y avait très peu de pics dans les 20 premières minutes du chromatogramme où mono-et sesquiterpènes éluer (Fig. 4). Ce manque de terpénoïdes volatiles appuie l'observation physique que le matériel végétal à base de plantes n'avait pas l'odeur traditionnellement associés au cannabis (McPartland et Russo, 2001). Fig. 5A-C, (et complémentaire Fig. S7A, B à JXB en ligne) sont les pannes des sous-régions du chromatogramme en phase gazeuse. Les pics majeurs dans la région de 13 à 30,5 min sont des acides gras libres (voir supplémentaires Fig.S7A à JXB en ligne). Le plus grand pic identifié comme l'acide palmitique est le plus abondant dans l'échantillon. Méthyle et de propyle cannabinoïdes élue dans la région 27-30 min
et les sommets marqués comme 286 et 302 Da Da avaient tous spectres MS compatible avec les cannabinoïdes propyle. Il ya eu deux pics de phtalate à environ 23,5 min (censé pour avoir provenu des sacs en polyéthylène dont les échantillons ont été fournis). Un certain nombre de phytocannabinoïdes ont été identifiés dans la région 30-34 min (Fig. 5A), y compris le cannabidiol (CBD), cannabichromene (CBC), cannabicyclol (CBL, un artefact de la chaleur générée par la SRC (Brenneisen, 2007), et cannabinavarin (CBNV , un analogue de propyle CBN). Dans la région de 34 à 36.3 min (figure 5B), en dehors de cannabinol (CBN), le plus important composant individuel phytocannabinoid, il y avait au moins quatre pics de 330 Da avec cannabielsoin (CBE, un artefact provenant de la CDB (Brenneisen, 2007) une identification probable du pic à 34,2 min. Dans la région de 36.3 à 40.5 min (Fig. 5C), le THC cannabitriol connus produit de dégradation (CBO) (Brenneisen, 2007) a été observée, ainsi que une série de pics présentant des similitudes spectrales de CBN, dont trois sont provisoirement identifiés par la base de données NIST que soit hydroxyle ou oxo-CBN La dernière région. (42 à 50 min;. voir Fig S7B supplémentaire à JXB en ligne), contenues phytostérols et les alcools triterpéniques avec le bêta-sitostérol le composé le plus abondant.

Fig. 3.Complete chromatographie liquide haute performance (HPLC) de cannabis ancienne.

Fig. 4. Remplissez un détecteur à ionisation de flamme chromatographie en phase gazeuse (GC-FID) de cannabis ancienne.

Fig.5. chromatographie en phase gazeuse des paragraphes cannabis ancienne. (A) de la CG de la région 30-34 min démontre phytocannabinoïdes plusieurs: le cannabidiol (CBD), cannabichromene (CBC), cannabicyclol (CBL), et cannabinavarin (CBNV). (B) de la CG de la région de 34 à 36,3 min affiche le plus haut sommet, le cannabinol (CBN), le métabolite directe non-enzymatique oxydative de THC, avec cannabielsoin possible (CBE) à 34,2 min.(C) de la GC de 36,3 à 40,5 région affiche cannabitriol min (CBO) un produit de dégradation du THC, et les variantes CBN (voir texte).


Les spectres de masse (MS) de phytocannabinoïdes sélectionnées correspondant à ce qui précède sont affichés (Fig. 6). Les valeurs sont toutes en accord avec ceux du NIST et de GW Pharmaceutical bases de données.

Fig. 6.Les spectres de masse du cannabis ancienne. Les paragraphes démontrer la cannabinol phytocannabinoïdes (CBN), le cannabidiol (CBD), cannabicyclol (CBL), cannabinolivarin (CBNV), cannabichromene (CBC), cannabielsoin (CBE), 1'-oxcannabinol, et 1'-hydroxycannabinol.

Il y avait un pic très petites détecté au temps de rétention correcte dans l'échantillon pour le THC, mais les spectres ne pouvait pas confirmer son identité.
L'analyse génétique

En raison du degré unique de préservation du cannabis, une analyse génétique a été entreprise. Les deux séquences d'ADN ancien déterminée ont été marqués Chine F et F de la Chine (h). Alignement de ces paléo-séquences (. Exclusion de la région les amorces, en rouge sur la figure 7A) avec les bases de données actuellement disponibles ont démontré:

Fig. 7. analyse de l'ADN du cannabis ancienne. (A) Les séquences nucléotidiques de la synthase d'acide tetrahydrocannabinolic sauvage F La Chine et la séquence mutante, en Chine F. (h), à deux polymorphismes surlignés en jaune minuscule. (B) traduction en acides aminés de la Chine et la Chine F F (h), la divergence en démontrant un changement de la sérine (type sauvage) de la thréonine (mutant), surligné en bleu.

(I) de Chine F (Fig. 7A) est identique 134/134 accord à d'autres séquences nucléotidiques déposés: AB212841, AB212839, AB212836, AB212833, AB212830, appartenant tous à l'acide tetrahydrocannabinolic synthases (THCA-synthases), une région spécifique de l'espèce génétiques (Schlumbaum et al., 2008) à partir de Cannabis sativa L.

(Ii) F Chine (h) (Fig. 7A) est une nouvelle variante, pas déjà présente dans les bases de données génétiques (soumis à NCBI, EU839988 numéro d'accession Genbank), démontrant une identité maximum de 132/134 nucléotides avec le ci-dessus séquences avec la Chine et F.

Utilisant BLASTX, à savoir effectuer des recherches grâce à la traduction en acides aminés, il a de nouveau montré que la Chine F (h) la séquence d'acides aminés n'est pas enregistré dans la base de données, et ceci est une confirmation évidente mais nécessaire, de l'originalité de cette variante de la synthase THCA allèle. Ces résultats prouvent aussi que les deux séquences codant pour la synthase THCA, l'enzyme de biosynthèse de THCA que décarboxyle par la chaleur ou au vieillissement pour donner psychoactives THC (Russo, 2007). La comparaison directe des deux séquences anciennes, identifié la nature de la légère différence observée: les échantillons ont deux «mutations» (. surligné en jaune dans la figure 7A), qui peut être considéré transversions: à partir de guanine à la cytosine, et de la cytosine à l'adénine . Le premier de ces deux substitutions nucléotidiques est synonyme, c'est à dire qu'il ne change pas la séquence d'acides aminés, tandis que le second est une substitution non-synonymes, conduisant à un échange de sérine-thréonine (surligné en bleu clair sur la Fig. 7B) dans le codée séquence d'acides aminés, ces deux acides aminés, cependant, ont des propriétés physico-chimiques. NO synthase CBDA, l'enzyme de biosynthèse de la CDB (de Meijer et al., 2003), a été identifiée dans l'échantillon.
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Discussion

Les résultats présentés collectivement la conclusion la plus probable est que la culture Gushi cultivé du cannabis à des fins pharmaceutiques, psychoactives ou divinatoires. En examinant les éléments de preuve botanique de ce «vieux et froid" site unique avec son degré de conservation, le cannabis se composait d'un traitement (moulu) l'échantillon dont les semences taille, la couleur et la morphologie, du moins selon les principes de Vavilov (Vavilov, 1926 ), suggèrent qu'il a été cultivé plutôt que de simplement recueillies à partir de plantes sauvages.La quantité considérable de cannabis présente (789 g) sans les tiges ou les branches grande serait logiquement impliquer une collection en commun plutôt que d'une seule plante. De plus, aucune des parties mâles évident plants de cannabis (par exemple fleurs mâles, pas rarement observée chez les Indiens d'herbe de cannabis, ou bhang (Russo, 2007) étaient évidents, ce qui implique leur exclusion ou le retrait possible par l'intervention humaine, car elles sont pharmacologiquement moins psychoactives.

Les analyses HPLC, GC, MS et confirmer l'identité de l'échantillon végétal que Cannabis sativa L. La prédominance des CBN indique que les plantes d'origine contenues Δ9-tétrahydrocannabinol (THC) comme constituant majeur phytocannabinoid. La présence de l'OBC et de nombreux pics substance CBN liées appuie également ce point de vue. CDB et de la SRC, ainsi que leurs produits de dégradation connue thermo-oxydation CBE et CBL (Brenneisen, 2007), sont présents, mais l'analyse GC semble indiquer que, dans les deux cas, la SRC et CBL sont représentés en plus grande quantité, comme prévu dans une haute teneur en THC du cannabis souche dans laquelle la CDB est seulement une composante mineure. En outre, il ya un pic pour CBNV qui confirme que l'usine contenait également Δ9-tetrahydrocannabivarin (THCV), un phytocannabinoid propyle. Toutes ces observations sont en accord avec les souches de cannabis à forte teneur en THC et dans une taxonomie alternative suggère qu'elle devrait être attribué à Cannabis indica Lamarck (Hillig et Mahlberg, 2004).

Bien que des temps d'élution chromatographie peuvent varier avec la température, le type de colonne, et d'autres facteurs, la confirmation a été évidente avec les valeurs justificatives spectres de masse qui étaient identiques à ceux observés dans les essais effectués quotidiennement sur le cannabis frais des extraits dans ce laboratoire.

La présence de tant de produits de dégradation reconnue des cannabinoïdes est conforme aux échantillons de cannabis très vieux. Les niveaux de concentration très faibles mesurées dans l'analyse HPLC peut indiquer que l'échantillon fourni contenu significativement plus de matière en feuilles et de brindilles que le matériel de fleurs, plutôt que d'être une preuve en soi que l'échantillon était de faible activité à l'origine. Ce matériel végétal est donc concluante cannabis provenant d'une population de plantes dans lequel le THC a été cannabinoïdes dominante. En revanche, un échantillon prélevé à partir d'un mélange de Cannabis sativa de type sauvage habituellement le port d'un mélange plus égales de THC et CBD (de Meijer et al., 2003). Il semblerait donc que l'homme choisi le matériel provenant de végétaux sur la base de leur teneur en THC supérieure à la moyenne.Pour élaborer un chimiotaxonomie de cannabis indiqué précédemment indique trois types (les petites et Beckstead, 1973): chémotype I (médicaments) avec des souches de haut-THC: ratios de la CDB, chémotype II faible teneur en THC, supérieur et la CDB (fibres) des souches, et chémotype II avec des rapports plus égaux.THC et CBD de production sont médiés par des allèles codominants BT et BD, respectivement (de Meijer et al., 2003). Par comparaison, les échantillons mis en commun des champs de cannabis au Maroc et en Afghanistan sera normalement produire 25% de plantes à haute teneur en THC, 25% des plantes de haute CDB, et 50% avec moins, les titres mixtes, combinant à fournir des quantités à peu près équivalent des deux phytocannabinoïdes (Russo , 2007), un modèle n'est pas observé dans notre échantillon.

L'analyse isotopique de la cellulose à partir de cet échantillon de cannabis pourraient éventuellement être utilisés en comparaison avec d'autres échantillons dans le but d'établir son origine géographique.

Bien que les plantes de cannabis à usages multiples utilisés simultanément pour la nourriture (graines), des fibres (tiges), et les applications pharmaceutiques (sommités fleuries) ont été récemment signalés dans Darchula dans l'extrême ouest du Népal (Clarke, 2007), plus habituellement, une plante donnée est le meilleur adapté à un but unique. D'une importance clé supplémentaire est l'absence d'artefacts de chanvre de la Yanghai tombes. Les vêtements fabriqués à partir de Gushi laine (voir Fig supplémentaire. S6b à JXB en ligne) et des cordes de Phragmites (roseaux) spp. fibres (voir Fig supplémentaire. S6C à JXB en ligne). Considérant que les textiles de chanvre ont été recueillies à partir de la culture nord de la Chine Yangshao from 6000-7000 ans BP, leur apparition dans l'ouest n'a pas été documentée avant 2000 ans BP, par exemple, 1500 ans BP à Kucha, 600 km à l'ouest de Turfan (Mallory et Mair , 2000).

analyses phytochimiques antérieures des préparations de cannabis antiques ont démontré empreintes digitales THC du cannabis reste du 19e siècle préparations (Harvey, 1990), y compris un échantillon de 140 ans de l'extrait Squire (Harvey, 1985). Une étude en 1992 a signalé la présence de Δ8-THC (précédemment appelé Δ6-THC) du cannabis qui aurait été brûlé par inhalation comme une aide à l'accouchement dans une grotte de Judée 1700 années BP (al Zias et al., 1993), appuyée par la constatation des résidus de cannabinoïdes dans un récipient en verre à côté (Zias, 1995). Dans la région du Mustang au Népal, les restes humains momifiés d'origine mongole probables ont été datées 2200-2500 ans BP en association avec le cannabis, probablement transportée d'ailleurs (Knörzer, 2000; Alt et al, 2003.), Mais avec suffisamment de détails pour déterminer son utilisation. Rudenko récupéré des graines de cannabis, des encensoirs, et les vêtements de chanvre dans Pazyryk, la Sibérie de kourganes scythes (tumulus) de 2400 à 2500 ans BP (Rudenko, 1970; Brooks, 1998), rapprochant le plus de descriptions d'Hérodote des rites funéraires pour que la culture (Hérodote , 1998). Sarianidi également réclamé l'usage du cannabis dans la Bactriane-Margiane archéologique complexe (BMAC) (aujourd'hui au Turkménistan) (Sarianidi, 1994, 1998), mais cette interprétation a été débattue (voir la discussion dans Russo, 2007).

Une autre analyse indépendante génétique de ce matériel publié suite de notre analyse (Mukherjee et al., 2008) ont confirmé la présence de la synthase THCA, mais pas les polymorphismes de nucléotides simples. Les auteurs posé une origine européenne et la Sibérie pour le matériel.

Actuel des données génétiques confirment également que le matériel végétal étudié est Cannabis sativa L. selon son analyse et ADNcp. Les résultats confirment aussi l'hypothèse de l'existence d'au moins deux séquences nucléotidiques THCA-synthase dans le matériel végétal ancienne examinés. L'une de ces séquences correspond parfaitement à la séquence correspondante du déjà-connu THCA-synthases déposées dans GenBank, en tant que séquences de gènes et de protéines, la deuxième séquence est nouvelle, avec deux polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) codant pour une protéine ayant vraisemblablement très des caractéristiques similaires. Que ces deux séquences ont coexisté dans une plante de cannabis ou d'une seule souche hétérozygotes au locus B, ou appartiennent à des plantes différentes, n'a pas pu être conclu.

THC représente l'un des possibles phytocannabinoid produits finis fabriqués par les plantes de cannabis, le THC (ou, dans sa forme native, THCA) est synthétisé par une enzyme bien caractérisés (THCA ou THC-synthase) à partir d'un précurseur (GBC ou CBGA) commune à la plupart des chémotypes qui représente «point de commutation" l'métaboliques en aval de laquelle la variabilité des différents chémotypes est concentrée. Les agents de cette variabilité génétique trouvé dans le cannabis sont exclusivement les synthases différents, parmi lesquels le THC (A)-synthase est le seul responsable de prendre cette cannabinoïdes spécifiques, le THC. Par conséquent, la présence du variant allélique responsable du codage du THC (A)-synthase peut ainsi être considéré comme diagnostic, ou du moins fortement évocatrice d'une usine de production de THC. Les plantes fossiles du cannabis disponibles ont donc été génétiquement équipés pour produire du THC. Combien de THC qu'ils produisaient, ne peut évidemment être précisée, car ils dépendent d'un certain nombre de facteurs anatomiques, environnementaux et nutritionnels qui restent inconnues.

De nombreuses questions demeurent. Les données actuelles ne le permettent pas à être déterminé comment le cannabis de la tombe a été administré. Si elle est utilisée par voie orale, c'était peut-être combinés dans une certaine manière avec Capparis spinosa L., que ces plantes ont été trouvés ensemble dans une tombe à proximité, mais plus tard, à Yanghai (Jiang et al., 2007). Cette date pour que le tombeau a été initialement rapportée de 2700 ans BP par la méthode du carbone, et depuis corrigé à 2200-2400 ans BP avec étalonnage supplémentaires utilisant des données dendrochronologiques. Si ce cannabis ont été fumé ou inhalé, aucun mécanisme pour ce faire a été excavé dans la région. Le Gushi pourrait avoir tamisé le cannabis à travers le tissu, après broyage, il fumigation, tout comme décrit pour le candidat présumé du cannabis, le A.ZAL.LA sumérienne, administrés en médecine pour "la main de fantôme» (Thompson, 1923, 1949), depuis posé comme l'épilepsie nocturne (Russo, 2007; Wilson et Reynolds, 1990). Bien que cette culture a pu arriver de la région antérieure BMAC 'trémies oasis »comme (Barber, 1999), et certaines relations culturelles sont évidentes pour la culture scythe à l'égard de la consommation de cannabis et les prouesses équestres, ces peuples ont pris la parole iranien (Mallory et Mair , 2000). En outre, Gushi affinités culturelles et pratiques funéraires beaucoup plus proches de celles de la langue proto-tokharien présumée, de l'encens qui brûle (Kuzmina, 1998) Afanasievo peuples dans la vallée du Ienisseï, au nord (Anthony, 1998, 2007; Mallory, 1998; Renfrew, 1998; Mallory et Mair, 2000), dont la présumée migration vers le sud, certaines autorités ont attribué à "refroidissement global" c. 4000 ans BP (Hsu, 1998), et à leur proto-indo-européenne de langue Yamnaya ancêtres plus à l'ouest, datant de 6000 ans BP (Mallory, 1989; Anthony, 1998; d'hiver, 1998). mystères restent abondantes sur les origines et les coutumes des Gushi. réponses supplémentaires peuvent découler de futures fouilles archéologiques ou de l'homme des analyses génétiques qui expliquent les relations avec d'autres cultures anciennes et modernes des peuples de la région. Le SNP unique découvert dans cet échantillon anciens peuvent encore être d'une importance critique dans la découverte de la propagation géographique de la phylogénie et de cannabis et les humains qui l'ont utilisé.

La très bonne conservation du cannabis à partir de ce tombeau a permis un niveau sans précédent de l'enquête de botanique moderne à travers la biochimie et la génétique de conclure que la plante était cultivée à des fins psychoactives. Si la culture du chanvre pour la fibre a été documentée dans l'Est de la Chine à partir d'une date beaucoup plus tôt (vide supra Mallory et Mair, 2000), les résultats actuels représentent la preuve la plus convaincante physique à ce jour pour l'utilisation du cannabis pour ses propriétés médicinales ou mystique.

Des données supplémentaires
Les photographies et schémas du site Yanghai tombes, Tomb contenu M90 y compris les tissus et des cordes, et autres informations chromatographiques et génétiques d'analyse de séquences d'amorces sont présentées dans les figures complémentaires S1-S8, disponible en ligne.
Fig. S1. Site d'étude sur les tombes Yanghai avec la gamme de montagne Huoyan Shan en arrière-plan (CDE photo).
Fig. S2. Diagrammes des tombes Yanghai (adapté du Xinjiang Institut des reliques culturelles et de l'archéologie, 2004, avec la permission).
Fig. S3. La tombe du chaman, M90 [issu en mandarin (Xinjiang Instgitute des reliques culturelles et de l'archéologie, 2004), utilisée avec la permission].
Fig. S4. Le chaman crâne (CDE photos).
Fig. S5. Les conteneurs dans lesquels le cannabis était stockée dans la tombe [issu en mandarin (Xinjiang Institut des reliques culturelles et de l'archéologie, 2004] utilisé avec permission.
Fig. S6. Re-excavation de la tombe de M90. Ceci a été entrepris de réexaminer artefacts, GPS mesure des coordonnées, et d'évaluer les conditions de l'environnement (CDE photos).
Fig. S7. paragraphes chromatographie de l'analyse phytochimique.
Fig. S8. Primer séquences utilisées dans l'analyse génétique pour amplifier THC et CBD-allèle fragments spécifiques et leurs séquences (5 '→ 3').
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Remerciements

Les auteurs sont reconnaissants à l'Académie chinoise des sciences et de GW Pharmaceuticals pour le soutien du projet. Kim Laughton facilité la communication et la logistique entre les autorités chinoises et le Home Office britannique pour l'exportation et l'importation du cannabis ancienne. Daniel Adams, Laura-Jane Everitt, et Helen Keogh effectué la préparation d'analyse phytochimique, supervisé par Peter Gibson. Ying Li a fourni une traduction et un soutien logistique à la CDE lors de travaux sur le terrain dans le Xinjiang. Gregory Gerdeman est remercié pour son commentaire utile de l'article, de même que les évaluateurs anonymes pour leurs suggestions.Aucun intérêts financiers concurrents étaient en vigueur pour cette étude.

contributions Auteur: EBR proposé et coordonné l'étude actuelle, engagée dans le travail de terrain, et a écrit les projets article. HEJ effectué la majorité des recherches de fond et a participé activement à des enquêtes en cours. AS a effectué l'analyse phytochimique et a écrit les méthodes pertinentes et sections des résultats. AC, FDB, et GM a effectué l'analyse génétique et a écrit les méthodes pertinentes et sections des résultats. co-DJP coordonné la manipulation de l'ancienne cannabis au Royaume-Uni, a effectué la microphotographie, et a écrit les méthodes et les résultats pertinents. EGL, XL, DKF, FH, YBZ, YFW, LCZ, et CJL ont tous été engagés dans les enquêtes antérieures par rapport à cette étude. YXZ analysé la phytochimie de l'échantillon de cannabis et SB et ses collègues ont analysé la phytochimie et de la génétique de l'échantillon de cannabis de façon indépendante.CSL a conçu le concept de l'étude des échantillons de cannabis archéologiques par des méthodes pluridisciplinaires, et organisé, coordonné et supervisé tous les aspects de l'étude actuelle et ses performances.
© 2008 Auteur (s).

Il s'agit d'un article d'accès ouvert distribué sous les termes de la Creative Commons Attribution licence non commerciale ( Creative Commons - Paternité-Pas d'Utilisation Commerciale 2.0 Royaume-Uni: l'Angleterre et le Pays de Galles - CC by-nc 2.0 ) qui permet sans restriction l'utilisation commerciale non, la distribution , et la reproduction sur tout support, à condition que le travail original est correctement cité.
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Source - Etude complète avec des graphiques: phytochimiques et les analyses génétiques de cannabis ancienne de l'Asie centrale?

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11ème Fiche:

préparation de thiosulfate d'argent (m) solution

thiosulfate d'argent (m) est couramment utilisé pour bloquer l'action de l'éthylène dans les cultures de cellules végétales. L'éthylène est une hormone qui est présente à l'état gazeux.augmente d'éthylène au cours de la sénescence et la maturation, et il a été montré pour augmenter de cultures de cellules végétales en raison de blessure ou de la présence d'auxines. Le nitrate d'argent peuvent être utilisés seuls pour bloquer l'action de l'éthylène, mais il n'est pas transporté, ainsi que m est donc rarement utilisé seul.

Préparer un de sodium à 0,1 m de thiosulfate de solution mère (m) en dissolvant 1,58 g de thiosulfate de sodium (produit pas. S 620) dans 100 ml d'eau. Préparer un recul de 0,1 m d'argent stock de nitrate solution en dissolvant 1,7 g de nitrate d'argent (pas de produit. S 169) dans 100 ml d'eau. Conserver la solution stock dans l'obscurité jusqu'à ce que nécessaire pour préparer les mailles.

La solution STS est préparé avec un rapport molaire entre l'argent et le thiosulfate de 1:4, respectivement. Presque tous de l'argent présent dans la solution est dans la forme de [Ag (S2O3) 2] 3 -, le complexe actif pour l'inhibition de l'effet d'éthylène.
Préparer un 0,02 m m en versant lentement 20 ml de solution 0,1 m d'argent stock de nitrates dans 80 ml de solution 0,1 m de sodium thiosulfate stock. Les mailles peuvent être stockés dans le réfrigérateur pendant jusqu'à un mois. Cependant, la préparation de la m juste avant l'utilisation est recommandée.
doświadczenia z STS
Cytat:

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Département d'horticulture, de l'Université du Wisconsin, Madison, Etats-Unis.

Certains cultivars de pomme de terre sont blessés lorsqu'ils sont cultivés sous irradiation continue et une température constante. À bien des égards la lésion ressemble à des effets de l'exposition d'éthylène: chute des feuilles, la chlorose, réduit la surface foliaire, et augmentation de l'épaisseur de la feuille. Cette étude a examiné l'importance de l'éthylène dans le développement de cette blessure en utilisant des applications de pulvérisation de thiosulfate d'argent (STS) ou l'éthylène-releasing Ethrel composé. Quatre cultivars ont été utilisés: Kennebec et Superior, qui sont sensibles à l'irradiation continue, et Norland et Denali, qui sont tolérants. Trois traitements par pulvérisation, 0,5 mM STS, 10 ppm Ethrel, et de l'eau, ont été appliquées deux fois par semaine.

Un contrôle non traitées a été inclus. Les plantes ont été 21 jours au moment de la récolte.STS a augmenté la surface foliaire, les feuilles et la tige du poids sec de 3 à 4 fois pour Kennebec et supérieure et ont considérablement réduit la chute des feuilles pour Supérieur et Norland. La croissance n'a pas été significativement affectés par l'application STS à Norland et Denali ou par application Ethrel par rapport à tous les autres traitements. Ces résultats suggèrent que le métabolisme de l'éthylène est l'un des mécanismes possibles par lesquels la pomme de terre est blessé par une irradiation continue.
Types de publication:

Abstracts Réunion *

Mots-clés: Darkness, Éthylènes, Light Plant, Feuilles, Radiation Solanum tuberosum, Température ,Thiosulfates,
L'eau D'éthylène, Radiothérapie thiosulfate d'argent, NASA Systems Discipline Life Support, Nombre de discipline
NASA 61-10 CELSS, Programme de la NASA, Centre de non-NASA
Cytat:
Comment inverser le sexe en utilisant Silver Solution de thiosulfate
Ce qui suit est une méthode sûre, peu coûteuse et efficace pour inverser le sexe des plantes de cannabis femelle. les réactions des plantes individuelles peuvent varier en fonction de la souche, mais je peux vérifier que ce processus est totalement efficace dans la stimulation de la production de fleurs staminées profuse.

Ce processus peut être utilisé pour:
A: créer de nouvelles graines féminisées de mères solitaires prix que vous avez actuellement
B: créer des hybrides féminisée-semences provenant de souches différentes du prix que vous avez actuellement
C: créer des graines féminisées pour une utilisation extérieure optimale
D: accélérer la "interview" phase de la culture, à la recherche de nouvelles, et intéressantes clone-mères
E: réduire le nombre total de la plante-idéal pour les utilisateurs médicaux avec des restrictions sévères et le nombre de plants
F: variété augmentation, en aidant à créer des emplois stables seedlines féminisée pour être utilisé comme une alternative aux clones

Au bas de ce post sont des détails spécifiques sur les produits chimiques utilisés, leur sécurité, leur coût, et où les obtenir.

Il est important de vous renseigner sur l'élevage du cannabis théorie et la technique avant d'utiliser une méthode comme celle-ci. Voici un lien vers "Marijuana Botany" Robert Clarke, qui est une très bonne référence.

"Marijuana Botany» par Robert Connell Clarke
(Manque malheureusement les annexes)

Il est également important de prendre des précautions de sécurité de base lors du mélange et la manipulation de ces produits chimiques, afin de lire les liens données de sécurité prévues. Le risque est similaire à mélange et la manipulation des engrais chimiques, et des procédures similaires de manipulation sont suffisantes.

Rappelez-vous: rien ne remplacera jamais un bon bagage génétique, et certains de vos primes doit toujours revenir vers les éleveurs professionnels de cannabis là-bas ... ceux qui ont travaillé pendant de nombreuses générations à venir avec leurs véritables chefs-d'œuvre d'élevage en F1. éleveurs de soutien professionnel en achetant leurs graines. Aussi, afin de Heaven's Stairway. Non pas qu'ils ont besoin d'une fiche de moi, mais ils sont très professionnels et très fournir un service rapide à travers le monde.

Préparation de la mission STS:
Tout d'abord, une solution de réserve est faite. Il se compose de deux parties (A et B) qui sont d'abord mélangés séparément, puis mélangés ensemble. La partie A est toujours mélangé dans la partie B, tout en agitant rapidement. Utilisez de l'eau distillée, eau du robinet peut causer des précipités à la forme.

Porter des gants lors du mélange et l'utilisation de ces produits chimiques, et mélanger et l'utilisation dans un endroit bien aéré. Un masque de prévenir la respiration de la poussière, qui est caustique. STS est incolore et inodore, et présente des risques minimes pour la santé s'il est utilisé comme décrit ici.(Voir matière de sécurité fiche de données de liens ci-dessous). Notez que le nitrate d'argent et STS peut causer des taches brunes sur le séchage, afin de pulvérisation sur les journaux et éviter de renverser.

Partie A: 0,5 grammes de nitrate d'argent délayé dans 500ml d'eau distillée
Partie B: 2,5 grammes de thiosulfate de sodium (anhydre) agité dans 500ml d'eau distillée

Le nitrate d'argent se dissout dans les 15 secondes. Le thiosulfate de sodium, prend 30-45 secondes pour dissoudre.

La solution de nitrate d'argent (A) est ensuite mélangé à la solution de thiosulfate de sodium (B) tout en agitant rapidement. Le mélange obtenu est une solution de thiosulfate stock d'argent (STS).

Cette solution mère est ensuite diluée dans un rapport de 1:9 pour obtenir une solution de travail. Par exemple, 100 ml de STS stock est ajouté à 900 ml d'eau distillée. Ceci est ensuite pulvérisée sur une sélection de plantes femelles.

Tant la STS stock et la solution de travail doivent être réfrigérés après leur utilisation, ainsi que les produits chimiques en poudre, pour éviter la perte d'activité. excès de solution de travail peut être en toute sécurité déversés dans les égouts après utilisation (avec de l'eau en cours d'exécution de menus) avec un impact environnemental négligeable. Il est assez bon marché.

Chaque litre de STS action prendra de dix lots de 1 litre de solution de travail de la mission STS. Avec la quantité minimum de produits chimiques de base commander Formulaire Photographe (voir lien ci-dessous), cela signifie que chaque bouteille de 1 litre de solution de travail STS coûte moins de 9 cents, et peut traiter 15 à 20 usines de taille moyenne.C'est 200 lots 1-litre de STS pour 18 $. Notez que l'eau distillée coûte beaucoup plus cher que les produits chimiques.

Application:
La STS solution de travail est pulvérisée sur une sélection de plantes femelles jusqu'à ce que les eaux de ruissellement. Ne la pulvérisation sur les journaux dans une zone séparée de la salle de fleurs. Vous n'aurez probablement pas d'odeur rien, mais tout de même ventiler. Vous avez maintenant ce que j'appelle un "F> M usine", une plante femelle qui produisent des fleurs mâles.

Après la F sèche> usine de M le déplacer dans 12/12 immédiatement. Cela se fait habituellement de trois à quatre semaines avant la date à laquelle la cible (à pollinisation libre) les plantes seront prêtes pour la pollinisation. temps de réponse peut varier légèrement selon la souche. fois plus spécifique peut être déterminée par essai avec vos propres souches individuelles. Dans mes essais il a fallu 26 jours pour le premier pollen. 30-35 jours semble optimale des fins de planification.

Ainsi, en supposant que la plante cible besoins 3-4 semaines pour produire des graines à maturité complète, une souche qui dure 8 semaines pour mûrir devrait être déplacé dans fleur à peu près au même temps que l'usine> femelle mâle. Une plante cible qui termine sa floraison en 6 semaines doit être déplacé en fleurs plus tard (10 jours ou plus) de sorte qu'il ne se termine pas avant que les graines puissent pleinement mature.

Une branche ensemencée individuels peuvent être laissés à mûrir sur une plante un peu plus longtemps, tandis que la récolte des bourgeons d'autres pépins s'ils arrivée en premier. Il suffit de laisser assez de feuilles pendant l'usine pour qu'elle reste saine.

Effets:
En quelques jours, j'ai remarqué un jaunissement des feuilles sur les plantes F M>. Cet effet a persisté pendant deux semaines ou si, après cela ils sont devenus de nouveau en vert, sauf pour quelques-uns des plus grands fans. Les plantes, autrement semblait en bonne santé. Aucune brûlure n'a été observée.Croissance s'arrêta net pour les dix premiers jours, puis reprend lentement. Aucun tronçon a été déjà vu. Après deux semaines de la F> M plantes étaient évidemment formant des grappes de fleurs mâles.Non seulement quelques-uns des grappes de ballons, mais complète hauts fleur mâle. Une plante toujours formé des fleurs femelles, mais globalement ce fut à prédominance masculine.

Il est étrange de voir une ancienne petite amie que vous connaissez sur le bout de votre main passer par un changement de sexe. Je vais vous avouer que les choses ont été difficiles entre nous au début.

Lorsque le F> plantes M regardent comme ils pourraient bientôt ouvert et la libération du pollen (3-1/2 à 4 semaines) les déplacer de la salle principale de fleurs dans une autre pièce non ventilée ou dans un placard avec un éclairage à une minuterie 12/12. Ne vous inquiétez pas trop de watts par pied carré, il ne sera que temporaire.

Lorsque le pollen d'oiseau, déplacez vos plantes cibles dans le placard et pollinisent.

Une approche plus contrôlée est d'isoler les F> M plantes dans un placard troisième à distance (pas de lumière est nécessaire à celui-ci, car ils sont la libération du pollen et maintenant presque terminé de toute façon). Dans ce placard à distance d'autres le pollen est très soigneusement collectés dans un sac en plastique produisent manchon ou un journal, puis ramené à la garde-robe lumineuse, où les plantes cibles se trouvent maintenant. Si cela est fait, attention à ne pas mélanger les types de pollen en laissant le F> Mme la poussière les uns les autres. Évitez de bouger, ou utiliser un autre placard.

Faites attention de ne pas laisser de recueillir du pollen à l'extérieur de ce sac-une charge statique est parfois présente. Drop petits amas ouverts de fleurs à l'intérieur et fermez le sac à la bouche et agiter.Important: étape suivante, à l'extérieur et relâchez lentement l'excès d'air du sac, il s'effondre complètement, de sorte que le pollen ne se libèrent accidentellement. Point sous le vent, ne laissez pas l'obtenir sur vos mains ou des vêtements.

Ce sac de pollinisation s'est effondré est maintenant très soigneusement glissé sur une seule branche, puis est lié étroitement au large à l'embouchure autour de la branche tige avec une attache ou un ruban, scellant ainsi le pollen à l'intérieur. Laissez gonfler le sac avec un peu d'air à nouveau avant de bouclage, de sorte que la branche peut respirer. Cette technique garde la plante entière à partir de semis. Agiter le sac un peu après le liant au large de distribuer le pollen. N'oubliez pas de l'étiquette de la branche afin que vous sachiez qui sont les graines qui. D'autres branches de cette même plante peut être frappé avec différentes sources de pollen.

Si pas de placard éclairé est disponible, la plante peut être déplacé dans la pièce principale, mais-très carefulollen est sournois. Après 4-5 jours, le sac est délicatement retirée et l'usine complète son cycle de floraison.

Une autre méthode a bien fonctionné pour moi. Je la position de la cible dans un plantes non-ventilé placard allumé, et puis je la récolte du pollen sur un morceau de miroir ou de verre. C'est ensuite soigneusement appliquée à la pistils d'une pré-branche marqué à l'aide d'un pinceau d'aquarelle très fine. On prend soin de ne pas agiter la succursale ou le pollen. Aucun éternuements. La plante doit être en premier lieu; le déplacer après la pollinisation ne peut ébranler sans pollen et souffler cette technique.

Indépendamment de la technique, à la fin vous aurez des graines féminisées. Laissez-les sécher pendant 2-4 semaines.

A propos des produits chimiques:
Le nitrate d'argent est une poudre blanche cristalline chimiques sensibles à la lumière qui est couramment utilisé dans la photographie. Il est également utilisé dans les yeux des bébés à la naissance pour prévenir la cécité. Il peut causer une légère irritation cutanée, et des taches brunes. Éviter de respirer. Je n'ai pas remarqué d'odeur ou de fumées, mais la ventilation est recommandée. Assurez-vous de laver le pulvérisateur bien avant de l'utiliser ailleurs, mieux encore: consacrer une bouteille d'utiliser STS. Un demi-gramme est une quantité étonnamment faible, il tiendrait dans une gélule.

Voici quelques liens vers des données de sécurité. Une recherche sur Google fera apparaître plus d'informations si nécessaire.

Nitrate d'argent d'infos:
ICSC: NENG1116 international de sécurité chimique (OMS / IPCS / ILO) | CDC / NIOSH
http://www.lions.odu.edu/ ~ redwards 20solution.pdf /...%

Pour une comparaison réaliste niveau de danger, voici un lien pour les données de sécurité et de manipulation du nitrate d'ammonium ou d'engrais commune:

thiosulfate de sodium est également un produit chimique cristalline blanche couramment utilisés en photographie, il est utilisé dans des fixateurs photographiques. générale mêmes précautions s'appliquent, moins la coloration. Cette formule utilise le type anhydre. Non dangereux.

Thiosulfate de sodium d'infos:
http://ptcl.chem.ox.ac.uk/MSDS/SO/s...hiosulfate.html
http://www.med-chem.com/MSDS/Sodium_Thiosulf.htm
Où se procurer les produits chimiques:
Produits chimiques photographiques, de la chimie photo, équipement de traitement de photo, produits chimiques photo
nitrate d'argent: 10 grammes: 10 $
http://www.photoformulary.com/Deskt...yID=27&langID=0
thiosulfate de sodium (anhydre): 100 grammes: 3,95 $
http://www.photoformulary.com/Deskt...yID=28&langID=0
Frais de port tourne autour de 4 $. Service rapide. Peut être expédiées au Canada.
Amusez-vous à expérimenter avec cette technique. Utilisez-le de façon responsable. Il ya quelques fils bien ici au CW qui entrent dans les avantages et les inconvénients des agents transsexuelles et féminisée. Lisez-les. Et surtout, l'utilisation STS de qualité F1 souches développées par des éleveurs professionnels pour les résultats les plus cohérents.

Un grand merci à Fet des frères Spice semences pour son aide et des conseils dans l'utilisation de cette technique. J'ai simplement apporté des informations disponibles ainsi que des postes précédents et tenté ma propre recette. Je suis ravi de partager les résultats. tests avenir sera fait pour régler la formule pour les rapports molaires des produits chimiques sont correctes, comme spécifié par Gobgoober (merci, Gob), mais la formule affichée ici est tout à fait efficace.
Cytat:

Thiosulfate d'argent pouvons en quelque sorte EVITER LEAF, DROP BUD ET FLEURS EN Hibiscus rosa-sinensis CAUSES PAR ETHYLENE ET TÉNÈBRES

Auteur: L. Høyer
Résumé:
La plante en pot Hibiscus rosa-sinensis s'est avéré être très sensibles à l'éthylène. Par conséquent, il a été examiné si le thiosulfate d'argent (STS) peut prévenir des feuilles, chute de bourgeons et de fleurs causés par l'éthylène et de l'obscurité. Une expérience phytotoxicological a eu lieu dans une serre et les plantes ont été pulvérisés avec des concentrations STS 5 dans l'intervalle de 0,05 à 4,05 mM à différents stades de développement. STS n'a causé aucun dommage et aucune séquelle de développement.

Une expérience de simulation de transport se composait de deux traitements fondamentaux: Darkness pendant 72 heures à 21 ° C sans éthylène appliqué et l'obscurité pendant 72 heures à 21 ° C avec 1,1 μ 1 éthylène 1-1. Les traitements STS comprend la pulvérisation de 0,45 et 4,05 mM 1, 11, ou 21 jours avant le début de la simulation du transport. La concentration d'éthylène de 1,1 μ 1 à 1 janvier sur les plantes non traitées causé un bourgeon total et la chute des fleurs et une baisse de plus petites feuilles. Les traitements avec STS pourrait dans une certaine mesure de prévenir la chute des bourgeons, mais les bourgeons restants sont devenus jaunes et ne se développent pas en fleurs ou les fleurs se décolorent et déformée. Lorsque les plants ont été exposés à une concentration d'éthylène de 1,1 μ 1 à 1 janvier de la concentration la plus efficace était de 4,05 mM STS pulvérisé 11 jours avant la simulation du transport. Le traitement avec les ténèbres sans éthylène a montré que les plantes avaient une mauvaise qualité de maintien.Une pulvérisation avec un STS 0,45 et 4,05 mM 11 jours avant la simulation du transport d'éthylène sans améliorer la qualité de conservation considérablement.
Cytat:

[[Tekst: envahir z:]]

L'article où vous faisant référence à porte:

L'induction de fleurs mâles fertiles en plantes génétiquement Homme Cannabis sativa de nitrate d'argent par une thiosulfate d'argent complexe anionique par HYMohan et R. Sett (théorique Appl Genet 1982; 62 (4):.. 369-375

Il couvre à la fois STS (25, 50 et 100 ug) et AgNO3 (50, 100 et 150 ug) de traitement.
Sur la base de ce document, et d'autres références (dans ce fil) J'ai répété l'expérience avec un 50, 75 et 100 ug solution AgNO3, et un 25, 50 et 100 solution STS. Aditionally J'ai fait un GA (50, 75 et 100 ug) de traitement.

Clones (trois à quatre nœuds) où enracinée pendant trois semaines avant le traitement. Ils ont été ensuite mis à 12/12. Une chute de 20 ul du composé d'essai a été appliquée apicalement chaque jour pendant 5 jours pour rattraper le montant total.

Les plantes traitées AgNO3 tourné un peu noir afer une semaine. Ils ont tous thoug recoverd, et après (environ) trois semaines à la fois STS et AgNO3 plantes plantes produites fleurs mâles. Les plantes traitées GA n'a pas produit maleflowers, ils ont juste allongé beaucoup. Après environ cinq semaines les fleurs ouvertes et le pollen est libéré. Dans les usines de donateurs pollenated, nouaison est devenu apperrent dans (environ) de trois semaines.

Bien que toutes les concentrations des deux STS et AgNO3 produit pollen viable, il ya eu une augmentation significative du nombre de fleurs mâles dans les plantes traitées avec une concentration plus élevée. La solution à 25 ug STS semblait un peu faible. Globalement, je pense à 100 ug STS ou une solution à 75 ug AgNO3 donne de beaux résultats, mais depuis une solution STS est préparé à partir d'une solution de AgNO3, et le 75 ug solution de AgNO3 n'a pas vraiment nuire à la plante, de 75 ug voorkeur AgNO3 mijn solution verdiend meunier!
Cytat:

Régulateurs de croissance en FLORICULTURE

Récemment, une combinaison de nitrate d'argent et de thiosulfate de sodium a été montré à plusieurs fonctions utiles dans la floriculture. thiosulfate d'argent inhibée abscission florale dans Schlumbergera (Cameron et Reid 1981, 1983). Beyer (1976) a montré que le nitrate d'argent constamment bloqué effets éthylène dans les plantes étiolées pois sans conséquences phytotoxique à des concentrations efficaces.

Veen et Van de Geijn (1978), nitrate d'argent pour être toxique à une concentration de saturation andincorporated thiosulfate de sodium pour augmenter la mobilité de l'argent sans saturation. Le nitrate d'argent a été seul phytotoxiques whenapplied aux poinsettias pour réduire épinastie pendant le transport.

Les attributs et les utilisations de thiosulfate d'argent ont été résumées par Veen (1983). Hausbeck et al.(1984) ont montré une corrélation entre l'application thiosulfate d'argent à géraniums de semis et de l'infection Pythium. Un obstacle majeur à l'utilisation commerciale d'argent contenant des composés est le manque d'espace étiquette. Les métaux lourds dans ces composés pourraient compliquer jeu, mais l'argent est un élément essentiel dans le traitement photographique et largement utilisé dans l'industrie cinématographique. Les avantages de thiosulfate d'argent dans abscission florale inhibition et de prolonger la vie du vase de fleurs coupées devrait justifier la demande d'attestation d'étiquettes par des chercheurs qui ont des données suffisantes et appropriées,
Cytat:

Mohan HY RAM1 et Sett R. 1

(1) Département de botanique, Université de Delhi, Delhi, Inde

Reçu le: 15 Novembre 1981 acceptés: 1 Février 1982

Communiquée par D. von Wettstein

Résumé apicale application de nitrate d'argent (AgNO3; 50 et 100 mgrg par plante) et de l'argent complexes thiosulfate anionique (Ag (S2O3) 2 3 -; STS, 25, 50 et 100 mikrog par plante) pour les plantes femelles du Cannabis sativa a induit la formation de la réduction des hommes, intersexuels et entièrement modifié fleurs mâles à la nouvelle ramifications primaires (PLB), 10 mikrog par plante de AgNO3 était inefficace et 150 traitements inhibiteurs mikrog prouvé.
Un nombre maximum de totalement modifié fleurs mâles ont été formés en réponse à 100 STS mgrg.Les fleurs mâles induite produit des grains de pollen qui ont germé sur les stigmates et les semences effectué ensemble. ions d'argent appliquée que STS a été plus efficace que AgNO3 dans l'induction des fleurs de modification du sex. L'induction de fleurs mâles sur des plantes femelles démontré dans ce travail est utile pour produire des graines qui donnent lieu à seules les plantes femelles. Cette technique est également utile pour le maintien de lignes gynoïques.

Mots clés Cannabis sativa - expression Sex - nitrate d'argent - Silver thiosulfate complexe anionique

[smooth]

12ème Fiche:

L'héritage d'armes chimiques phénotype de Cannabis sativaL.
PM Etienne de Meijer 1 , un , Manuela Bagatta b , Andrea Carboni b , Paola Crucitti b , Cristiana Moliterni
VM b , Paolo Ranalli b , et Mandolino Giuseppe b
une BV Hortapharm, 1075 VS, Amsterdam, Pays-Bas
b Istituto Sperimentale per le Colture Industriali, 40128 Bologne, Italie
Auteur correspondant: Giuseppe Mandolino, Via di Corticella 133, 40128 Bologne, en Italie,. g.mandolino @ isci.it(E-mail)
Communiquer éditeur: CS G ASSER

Résumé

Quatre croisements ont été faits entre consanguins Cannabis sativa plantesavec cannabidiol pur (CDB) et pure -9-tétrahydrocannabinol (THC) chémotypes.Toutes les plantes appartenant à la F 1's ont été analysés par chromatographie en phase gazeuse pour la composition en cannabinoïdes et trouve constamment d'avoir un CDB-THC chémotype mixtes.Dix individuelles F 1 plantes ont été autofécondées, et 10 F consanguines 2enfants ont été recueillies et analysées.Dans tous les cas, une ségrégation des trois chémotypes (CDB pure, mixte CBD-THC, le THC pur et) montage d'un proportion 01:02:01 a été observée. Le CBD / THC a été constaté de manière significative descendance spécifiques et transmis par chaque F 1 de la F 2 's qui en découlent. Un modèle impliquant un locus, B , avec deux allèles, B D et B T , est proposé, avec les deux allèles codominants être. Les chémotypes sont interprétées comme étant dues au génotype B D / B T à la B locus, tandis que le pur-chémotype plantes sont dues à l'homozygotie au B locus (soit B D / B D ou B T / B T ). Il est suggéré que codominance est due à la codification par les deux allèles pour les différentes isoformes de lasynthase même, ayant une spécificité différente pour la conversion de l'cannabigerol précurseur commun dans la CDB ou THC, respectivement. Les F 2 groupes de ségrégation ont été utilisés dans un en vrac analyse de ségrégation de l'ADN mis en commun pour le dépistage des amorces RAPD, trois chémotype associée marqueurs sont décrits, dont l'un a été transformé en une-région amplifiée de séquence (SCAR) marqueur et montre le lien étroit à chémotype et codominance.

C HEMOTYPICAL la diversité dans le cannabis: La classe de produits secondaires propres à l'espèce dioïque Cannabis sativa L. (Chanvre) est l'substances terpénophénoliques connu sous le nom cannabinoïdes, qui s'accumulent principalement dans les trichomes glandulaires de la plante (M ECHOULAM 1970 ; H AMMOND et M AHLBERG 1977 ). Plus de 60 cannabinoïdes sontconnus (DE A à Z eeuw et al. 1972 A ), Le cannabidiol plus abondantes étant (CDB) et -9-tétrahydrocannabinol (THC). D'autres cannabinoïdes commune sont cannabichromene (CBC; H Olley et al. 1975 ) Et cannabigerol (CBG). Ces cannabinoïdes ont une chaîne latérale pentyle, mais aussi leurs homologues propyle se produisent, qui sont indiqués comme cannabidivarin (CBDV), -9-tetrahydrocannabivarin (THCV), cannabichromevarin (CBCV), et cannabigerovarin (CBGV), respectivement (DE A à Z eeuw et al. 1972 B ).
S MALL et B ECKSTEAD 1973 furent les premiers à systématiquement enquête auprès d'un grand nombre d'adhésions de cannabis pour la variabilité dans la composition des cannabinoïdes. Ils ont reconnu, sur une population moyenne de base, trois phénotypes chimiques (chémotypes): chémotype I, avec une teneur en THC> 0,3% et une teneur en CBD <0,5% de l' inflorescence de matière sèche, un chémotype intermédiaire II, avec la CDB que le cannabinoïde répandue mais aussi THC présent dans diverses concentrations, et un chémotype III, avec faible teneur en THC particulièrement contenu. Ces chémotypes étaient censés être associés principalement à une provenance géographique. Aucune étude sur les rôles respectifs de l'hérédité et l'environnement sur l'expression chémotype ont été effectuées.modèles tripartite de CBD / distributions ratio THC ont été reconnus au sein des populations parF OURNIER et P ARIS 1979 et par F OURNIER 1981 . D E M EIJER et al. 1992 , Dans une enquête d'une grande collection de cannabis, a également constaté que les plantes appartenant à la même population montrent souvent distincts CBD / ratios THC. Un rare, chémotype supplémentaires, caractérisée par une très faible teneur en THC des deux et la CDB et avec GBC comme constituant majoritaire, a plus tard été identifié par F OURNIER et al. 1987 .
La biosynthèse des cannabinoïdes

Dans la plante de cannabis, les cannabinoïdes sont synthétisés et accumulés comme des acides de cannabinoïdes [ par exemple , l'acide cannabidiolique (CBDA)]. Lorsque le produit est séché à base de plantes, stockés, ou chauffés, les acides decarboxylize progressivement ou complètement dans les formes neutres (par exemple , CBDA CDB). Pour plus de commodité, cet article indique tous les cannabinoïdes par les abréviations pour leurs formes neutres.
La première étape spécifique dans la biosynthèse des cannabinoïdes est la condensation de réaction de géranylpyrophosphate (PPM) avec le polycétide, l'acide olivetolic (OA), qui est catalysée par l'enzyme géranylpyrophosphate: olivetolate geranyltransferase (GOT; F ELLERMEIER et Z ENK 1998 ;F ELLERMEIER et al. 2001 ). La CBG qui en résulte est le précurseur direct de la CDB (T AURA et al. 1996 ) Et CBC (G AONI et M ECHOULAM 1966 ; M Orimoto et al. 1997 ,M Orimoto et al. 1998 ). Dans les anciennes références THC était considéré comme un produit de cyclisation en outre de la CDB (S HOYAMA et al. 1974 ). Plus tard,F OURNIER et P ARIS 1980 supposer que cette voie, la CBG CDB THC, est caractéristique des souches de fibres seulement. Pour les souches de drogue, qui sont souvent dépourvues de même des traces montants de la CDB, la conversion directe de la CBG en THC était censé être typique.Aujourd'hui, le THC est considéré comme provenant directement du GBC dans toutes les variétés de cannabis ( figure 1B ), l'existence de la CDB enzyme postulé-cyclase catalysant la synthèse de THC par la CDB n'a pas été confirmée expérimentalement (T AURA et al. 1995 ). L'homologue de propyle de la CBG, à savoir , CBGV, est formé si un C 10 , au lieu de la commune C 12 version de l'arthrose, se condense avec GPP (S HOYAMA et al. 1984 ; F ELLERMEIER et Z ENK 1998 .) Les in vivo conversions de la CBG (V) dans les produits finis THC (V), la CDB (V) et CBC (V) sont enzymatiques, et pour chaque réaction d'une enzyme a été identifié: synthase THC (T AURA et al. 1995 ), La CDB synthase (T AURA et al. 1996 ), Et CBC synthase (M Orimoto et al. 1998 ). S HOYAMA et al. 1984 démontré que l'extrait enzymatique à partir d'une souche de cannabis contenant de la CDB et le THC est capable de convertir en CBGV THCV et CBDV.Cette dernière constatation implique que le THC, CBD, et probablement aussi synthase Radio-Canada,sont en mesure de traiter homologues de la CBG, peu importe la longueur de leur chaîne latérale alkyle.

Figure 1. (a) chromatogrammes GC d'individus femelles appartenant à trois chémotypes différents (CDB pure, pure-THC, et chémotype mixtes) à partir de lignées différentes sont représentées. L'axe horizontal indique le temps de rétention et l'axe vertical du signal du détecteur (picoamps).et THC pics apparaissent dans la CDB de 10.439 à 10.442 et 11.063-11.075 intervalle min, respectivement. (B) La voie de biosynthèse des cannabinoïdes est montré (modifié d'aprèsF ELLERMEIER et al. 2001 ). 1, géranylpyrophosphate; 2, l'acide olivetolic; 3, CBG (V); 4, CBC (V); 5, le THC (V); 6, la CDB (V); I, géranylpyrophosphate: geranyltransferase olivetolate (GOT); II, Radio-Canada (V) synthase; III, le THC (V) synthase; IV, la CDB (V) synthase. R 1 (= C- 3 H7 ) et R 2 (= C- 5 H 11 ) et d'indiquer les formes pentyle propyle des différents métabolites.




héritage Chémotype

Il n'est guère douteux que les facteurs environnementaux ont une forte influence dans la modulation de la quantité de cannabinoïdes présents dans les différentes parties des plantes à différents stades de croissance, tel que démontré par un certain nombre d'articles ( par exemple , L YDON et al. 1987 ; B AOSC et al. 1997 ). Toutefois, la répartition tripartite des ratios THC CDB dans la plupart des populations est susceptible de sous-tendent un héritage discret du caractère chémotype. En effet, la plupart des auteurs s'accordent que les profils génétiques des cannabinoïdes sont en forte contrôle. Selon B Rutler et DER M ANDEROSIAN 1978 , Leratio de la CDB / THC est un marqueur chimique de signification taxonomique. F OURNIER et al. 1987 a déclaré que le profil de cannabinoïdes de chaque plante et donc son CBD / THC ratio est principalement dépendante de son bagage génétique et que chacun plante appartient toujours à son groupe chimique distincte tout au long de son cycle de vie.
Aspects quantitatifs et qualitatifs de l'accumulation des cannabinoïdes sont souvent confondues comme l'a souligné H ILLIG 2002 dans une critique des observations sur S YTNIK et S TELMAH 1999 .Pour spécifier la cible de l'article actuel, il est suffisant pour exprimer le rendement de certains un cannabinoïde par unité de surface des cultures comme un caractère complexe,

(1)
CY où n est le rendement des cannabinoïdes, n (grammes par mètre carré); DM est le montant total du sol sec, au-dessus- de la biomasse (en grammes par mètre carré); P flor est la proportion du poids des feuilles et des bractées inflorescence (grammes par gramme); C tot est le cannabinoïde contenu total dans les feuilles et les inflorescences fraction bractée (grammes par gramme), et PC n est «pureté», la proportion des cannabinoïdes n cannabinoïdes dans la fraction totale (grammes par gramme).
Les trois premières composantes de déterminer le rendement des cannabinoïdes sont probablement caractères polygéniques pas liée à métabolique spécifique des voies et sont fortement influencés par l'environnement. En revanche, ce dernier terme de l'équation 1 , la proportion d'un cannabinoïde certains cannabinoïdes dans la fraction totale, dépend strictement de la métaboliques des voies suivies par la plante pour convertir précurseurs communs en produits finis spécifiques. L'objectif de cet article est sur les proportions des deux le plus souvent trouvés et abondante cannabinoïdes, la CDB et de THC, et limite la définition du chémotype au rapport de la CBD / THC, avec les deux termes exprimés en pourcentage du poids sec inflorescence.
F OURNIER et P ARIS 1979 , F OURNIER et P ARIS 1980 et F OURNIER 1981 fait état d'une coupe de séparation claire / ratios THC CDB au sein de cultivars à fibres français. Deux groupes peuvent être distingués dans un rapport de 1:4, le premier composé de plantes avec un mélange de THC-profils de la CDB et l'autre des plantes avec la CDB assez pure profils. Y OTORIYAMA et al. 1980 analysé les F 2 de F 1 hybrides contenant à la fois de la CDB et de THC dans des quantités semblables et la ségrégation de la pure chémotypes avec la CDB, mixte CBD-THC, le THC pur et profils dans un rapport 1:2:1. Les générations suivantes de la CDB plantes pures ont été étudiées plus complètement et ils ont montré un CDB chémotype fixe. B écus et al. 1998 évalué une ségrégation F 2 et supposé un héritage monogéniques de THC et CBD ratios. Ce n'a pas été confirmée par d'autres auteurs (S YTNIK et S TELMAH 1999 ).


marqueurs d'ADN dans le cannabis

Aujourd'hui, le concept de cannabis comme un genre monotypique est largement acceptée; taxonomique, morphologiques, et des études biométriques confirment la continuité de son patrimoine génétique en dépit de la très forte variation trouve à l'intérieur et entre les populations (S MALL et al. 1976 ;DE M EIJER et K Eizer 1996 ).Dans les quelques dernières années, l’existence d'une seule espèce dans le genre a été confirmé par des études de marqueurs moléculaires qui montrent un nombre limité de ségrégation des différents groupes au sein du genre Cannabis et un haut degré de polymorphisme extrêmement, estimée à la même ampleur au sein et entre les populations (F AETI et al. 1996 ; F ORAPANI et al. 2001 ). Dans quelques-uns des plus connus cultivars de chanvre, par exemple , Carmagnola, le degré de polymorphisme a été estimée par hasard ADN polymorphe amplifié (RAPD) pour impliquer 80% des marqueurs de score, et les données suggèrent un énorme réservoir de variation à l'intérieur même de la plupart des sélectionnés variétés de cannabis considérées lors de l'étude. Enfin, dans les populations dioïque, la présence d'un nombre élevé de marqueurs spécifiques des hommes, probablement associé avec le chromosome Y, a été trouvé par RAPD et polymorphe amplifié au fragment d'analyse (M ANDOLINO et al. 1999 , M ANDOLINO et al. 2002 ; F Lachowsky et al. 2001 ).


But des travaux

Cette étude vise à clarifier l'héritage de chémotype cannabinoïdes, en isolant la CDB pure et pure des lignées consanguines de THC. Un héritage simple modèle a été proposé après avoir fait des croisements entre les chemotypically lignes contrastantes et d'examiner un certain nombre de F 1 et F 2 descendances. Une analyse RAPD des lignées parentales et de leur progéniture a été effectuée et un certain nombre de marqueurs associés à chémotype ont été décrites.


MATÉRIELS ET MÉTHODES

évaluation Chémotype:
Mature grappes florales ont été recueillies auprès de chaque individu(plante). Les grappes de fleurs ont été séchés à l'air, et 50 mg de feuilles matériel a été pesés dans un tube de filtration (Ultrafree-CL, 0,1 um; Millipore, Bedford, MA). Les étapes suivantes ont été ensuite répété quatre fois: 1 ml d'éthanol (99,7%) a été ajouté, l’échantillon a été traité par ultrasons dans l'éthanol pendant 15 min, et l'extrait a été centrifugé à 4000 tr / min pendant 10 min. Ensuite, le total de 4 ml d'éthanol contenant des cannabinoïdes extrait a été transféré à partir du tube de filtration à un ml en flacon de 5; 0,25 ml d'une solution stock phénanthrène (10 mg / ml dans l'éthanol) a été ajouté comme standard interne et le volume a été ajusté à 5 ml avec de l'éthanol. Enfin, des extraits ont été homogénéisés et transférés dans des flacons de GC. Chromatographie en phase gaz analyses ont été réalisées sur une imprimante Hewlett-Packard GC 6890 équipé d'un échantillonneur automatique et un détecteur à ionisation de flamme. Deux colonnes ont été utilisées: (légèrementpolaires) HP-5, 320 um x 30 m, avec-um film de 0,25 pour l'analyse quantitative des charges générales échantillon plus grand, et le non polaires HP-1, 100 um x 40 m, avec 0,20 film um pour une séparation précise de la CDB de la CBC. l'humidité moyenne du contenu par descendance étudiée a été déterminée par séchage des échantillons de la matière florale à 105 ° pendant 3 heures. Correction d'humidité et facteurs d'une équation linéaire d'étalonnage, obtenue avec un CDB gamme de concentration, ont été utilisés pour convertir les dérivés de pointe zones-GC concentrations en poids sec. Identités des composés ont été déterminées en comparant les temps de rétention avec ceux des étalons purs.
Constitution d'une lignée pure:
Tous parentaux utilisées dans cette étude ont été doublement plantes consanguines (S 2 's) obtenu grâce à l'autofécondation de certains clones femelles de la collection de cannabis Hortapharm BV, Pays-Bas.Les plantes ont une ou l'autre de la CDB, ou THC, comme la prédominance des cannabinoïdes. Le clone 00.45.1 a été une exception, ayant à la fois de la CDB et de THC, en quantités similaires. Les clones ont été obtenus par in vivo propagation des branches latérales. Une personne de chaque clone a été partiellement sexe inversé selon la procédure décrite par M Ohan R AM et S ETT 1982 et a permis à l'autopollinisation dans l'isolement. Dans de nombreux cas il a été possible de recueillir suffisamment de graines viables pour constituer une génération consanguines première ligne (S 1 ), qui a été entièrement féminin et montrant le chémotype même que le clone parental. Le 00.45.1 S 1 , toutefois, séparés enpure CDB, mixte CBD-THC, le THC pur et individus. Ici, outre la consanguinité a été limitée à la CDB plantes pure. Un S 2 génération a été produite à partir de certains des S 1 plantes, selon la même procédure décrite ci-dessus. Les travaux ont porté sur six S 2 lignes, brièvement décrites dans le tableau 1 . Un échantillon de feuilles ont été recueillies pour l'analyse de l'ADN de 10 à 20 plants par S2 .

Tableau 1. Caractéristiques des lignées consanguines parentales
La production de F 1 de l 'et F 2 's:
Sept plantes individuelles appartenant aux six S 2 lignes avec contraste chémotypes ont été choisis pour produire des hybrides F 1 'art L'individu plantes femelles utilisés comme parents mâles ont été partiellement infirmé le sexe et placés dans des armoires d'isolement avec les parents femelles. Les croisements réalisés sont résumés dans le Tableau 2 .

Tableau 2. Pedigrees et les codes de la descendance étudiée

La saison suivante, un nombre variable de plantes individuelles de l' autre F quatre 1 's ont été cultivées et leur chémotype a été déterminée. Encore une fois, des échantillons de feuilles de 5 à 20 plantes appartenant à la F quatre 1 's ont été prises pour l'analyse moléculaire. Dix F 1 des plantes (3 usines de croix 99,3, 3 de 99,4, 1 de 99,5, et 3 de 99,6; tableau 2 ) ont été de nouveau traité pour obtenir la réversion du sexe partielle, isolée, et a permis de mettre en F 2 graines. Les graines ont été semées etun nombre variable de F 2 plantes adultes, allant de 35 à 118, ont été évalués pour chémotype; des échantillons de feuilles ont été collectés à nouveau pour l'analyse de l'ADN. Pendant trois saisons (1998-2000), le cycle complet de l'parental S 2 lignées différentes de la F 2 descendances a été réalisée dans des conditions similaires à effet de serre et l'isolement strict. Confirmation de la féminité génétique de toutes les plantes a été fondée sur l'absence de tout mâle-spécifiques marqueur.
L'analyse moléculaire:
A partir de chaque échantillon de feuille de prises S 2 , F 1 et F 2 plantes individuelles, l'ADN génomique a été préparé en utilisant le kit Phytopure nucléon (Amersham Pharmacia Biotech, dans le Buckinghamshire, au Royaume-Uni). La concentration d'ADN de chaque échantillon a été ajusté à 1 ug / ul après 260-nm lectures, et 20 ng ont été utilisés pour des réactions d'amplification. RAPD analyse à l'aide décamère amorces de séquence aléatoire (achetés à partir Technologies Operon, Alameda, CA, et les acides nucléiques-protéines Service Unit, Laboratoire de biotechnologie de l'Université de la Colombie -Britannique, Canada) et électrophorèse sur gel ont été réalisées comme décrit par ailleurs (F AETI et al. 1996 ). Pour l'analyse de S 2 et F 1 personnes, une matrice composée de 1 et de 0 a été obtenu après avoir marqué les bandes RAPD reproductibles après au moins deux cycles d'amplifications du même modèle. Le nombre de loci et le pourcentage de polymorphisme ont été calculéssur la base de ces matrices. F 2 échantillons ont été analysés par analyse de ségrégation en mélange (M ICHELMORE et al. 1991 ); Sept paires de vracs ont été composées à partir des contrastes (CBD et le THC) chémotypes de la F 2 en mélangeant des quantités équimolaires de l'ADN de 6 à 14plantes individuelles par chémotype pour chacun des sept descendances. L'analyse RAPD du vrac des échantillons d'ADN a été effectuée comme décrit ci-dessus pour une analyse individuelle. les bandes d'ADN unique différencier la F 2 ont été élues vracs du gel en utilisant le gel QIAquick kit d'extraction (Qiagen, Valencia, CA) et cloné dans le vecteur pGEM-T système de vecteur II (Promega, Madison, WI); Escherichia coli cellules (souche JM109 ) ont ensuite été transformées avec le plasmide recombinant en utilisant le Pulser électroporateur Gene (Bio-Rad, Richmond, CA ) et étalées sur des supports adaptés. Les clones positifs ont été séparément en culture, et les inserts ont été excisé du vecteur plasmidique, marqués par le [ - 32 P] dCTP selon F EINBERG et V OGELSTEIN 1983 , Et utilisés comme sondes dans des expériences d'hybridation Southern blot des produits amplifiés par RAPD comme décrit par ailleurs (M ANDOLINO et al. 1999 ), Pour vérifier l'identité du fragment cloné avec le marqueur RAPD original. Une fois l'identité a été confirmée, l'insert d'ADN a été séquencé en utilisant le BigDye Terminator cycle kit de séquençage (Applied Biosystems, Foster City, CA) et le séquenceur automatique AbiPrism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). A partir de séquences obtenues, spécifique-mer amorces 20 ont été construits et testés dans des réactions PCR réalisée dans les mêmes conditions décrites par ailleurs (M ANDOLINO et al. 1999 ).
RÉSULTATS

Variation dans la composition des cannabinoïdes:
Des exemples de profils de chromatographie en phase gazeuse cannabis sont présentés dans la figure 1A . Les variations observées dans les adhésions est généralement à deux niveaux de récepteurs cannabinoïdes de type (temps de rétention) et le montant (aires des pics différents), confirmant d'autres auteursobservations (S MALL et B ECKSTEAD 1973 ;DE M EIJER et al. 1992 ). Plantes avec seulement une seule dominante cannabinoïdes (THC ou de la CDB dans cette étude) sont présents que 95-98% du total des cannabinoïdes contenu ( figure 1A , en haut et milieu chromatogrammes). Ces plantes sont appelées ici comme chémotypes pur et se trouve naturellement survenant dans les adhésions ou peuvent être produits par le croisement ou d'auto-fertilisation des plantes montrant une chémotype mixtes ( figure 1A , en bas chromatogramme; voir ci-dessous).
S 2 lignées:
Si le clone à l'origine utilisé pour produire la S 2 a été d'une pure CDB ou chémotype THC, ce chémotype est préservée tout au long de toutes les générations consanguines ultérieure, bien que l'absolu montant des cannabinoïdes dominante montre encore considérable variation, comme en témoignent les écarts-types trouvés ( Tableau 1 ).
L'analyse moléculaire réalisée sur le S 2 lignes a suggéré une réduction de la variation génétique au sein de ces matériaux, en particulier si on les compare avec les populations noninbred comme précédemment examiné (F ORAPANI et al. 2001 ). Le pourcentage de polymorphisme détectable par analyse RAPD (trois amorces) variait de 17,3 à 46,4% ( tableau 1 ), alors qu'il a été rapporté que 65 à 80% au sein de la commune italienne de fibres français et la plupart des cultivars (F ORAPANI et al. 2001 ).
F 1 hybrides:
Lorsque le S 2 plantes ont été croisées mutuellement comme indiqué dans le tableau 2 , tous les F 1plantes examinées contenaient à la fois de la CDB et de THC dans considérables quantités, et pas chémotypes pure ont été découverts. Un exemple de la distribution de la F 1 plantes (F 1 99,3) dans un CDB vs parcelle THC est présenté dans la figure 2 , où les valeurs des plantes parentales sont également indiquées. figure 2 montre un effet hétérosis pour les cannabinoïdes contenu total (CDB + THC), et notamment une forte augmentation de la teneur de la CDB F 1 's par rapport à la CDB contenu parental. Des tendances similaires ont été trouvés dans deux de l'autre F 1 'art Cependant, il n'y avait pas un tel effet sur le total du contenu des cannabinoïdes dans le F 99.4 1 .

Figure 2. CDB vs . teneur en THC du 99,3 F 1descendance. Les positions de la F 1 plantes sont indiqués par des triangles ouverts; leurs parents (appartenant à la ligne CDB 94.4.12.63 et à la ligne de THC 55.22.7.10, respectivement) sont indiqués par des carrés vides. La teneur en cannabinoïdes est exprimée en pourcentage du poids de la matière sèche, mature inflorescence.

Étonnamment, la CDB / THC semble varier d'une manière claire -voie spécifique descendance. Le ratio moyen varie de façon significative ( P <0,001) de 0,50 (F 1 99,4) à 1,57 (F 1 99,5), où seulement quatre usines ont pu être analysés ( Tableau 3 ).

Tableau 3. CBD / ratios THC des plantes hétérozygotes

L'analyse moléculaire de la F 1 plantes a été à nouveau réalisée en utilisant trois amorces RAPD et en comparant les loci identifiés dans les plantes parentales avec ceux présents dans la F 1 descendances.Au cours des quatre descendances, de 5,6% (99,3) à 37,5% ( 99,4) des loci RAPD a marqué dans les usines de parents séparés dans la F 1 (données non présentées). Cela indique qu'un nombre significatif encore de loci ont été à l'état hétérozygote dans le S 2 parentals.
F 2 lignées:
La CDB contre des teneurs en THC de l'un des F 2 de l 'examen sont tracées dans la figure 3 . Au sein de chaque F 2 , les individus pourraient sans aucun doute être attribué à trois différents groupes de ségrégants sur la base des discontinuités importantes dans le CBD / ratios calculés THC. Les donnéessur la ségrégation des chémotypes dans le F différents 2 's sont indiqués dans le tableau 4 . Pour tous les F 2 's, les résultats de la 2 test accepté le modèle d'un seul locus avec deux allèles codominants. Dans les F 2 d 'où les ratios de ségrégation plus dévié de 1:02:01 plus grand ( 2 valeurs), il est resté constamment en raison d'une sous-représentation des chémotypes CDB pure.


Figure 3. CDB vs . parcelle teneur en THC du 99.6.14 F 2 descendance (cercles). Les positions des F seule une plante (triangle ouvert), auto-fécondé pour obtenir ce F 2 , et de la CDB et pure-pure-THC parents initial (carrés vides) sont indiqués.Cannabinoid contenu est exprimé en pourcentage du poids de la matière sèche, mature inflorescences.

Tableau 4. données de ségrégation Chémotype

Comme dans la F 1 's, la CDB / THC pour les plantes hétérozygotes dans la F 2 de l 'apparut de nouveau d'être fortement dépendante descendance. ANOVA et de comparaisons multiples au-squared différence (LSD) test effectué sur hétérozygotes / ratios THC CBD de tous les F évalué 1 et F 2descendances ont montré des différences significatives entre les très descendances ( P <0,001;tableau 3 ). En particulier, les 99,4 descendants forment un groupe distinct très car ils sont constitués des hétérozygotes ayant une plus forte proportion beaucoup plus de THC que de la CDB. Dans tous les autres descendants de la proportion de la CDB chez les hétérozygotes dépasse, à des degrés divers, la proportion de THC. Petite, mais néanmoins significatif, les différences dans la moyenne de la CDB / THC ne se produisent chez les descendances partage le même pedigree. Toutefois, la F 1 CBD / ratios THC (évalué dans une année différente de la F 2 rapports) sont transmis avec peu de changements très à l'hétérozygotes de la correspondante F consanguines 2 'art
Les marqueurs moléculaires associés à chémotype:
La coupe nette ségrégation observée dans tous les F 2 d 'considéré comme permis l'application de l'analyse de ségrégants en vrac (BSA; M ICHELMORE et al. 1991 ) Stratégie pour trouver des marqueurs moléculaires liés à chémotype. Sept paires de vracs d'ADN ont été réalisés, correspondant à la F 2 descendances 99.3.10, 99.3.49, 99.4.2, 99.4.6, 99.4.10, 99.5.5, 99.6.25 et, et chacun était composé de 8 - 10 ADN des groupes chémotype contrastées. Cinquante amorces RAPD ont été utilisés pour cribler les sept volumes, et 400 bandes ont été marqués. Dans plusieurs cas, les bandes discrimination une ou plusieurs des vracs ont été observées, mais seulement trois amorces, OPA07 (5'-GAAACGGGTG-3 ') et OPB06 (5'-TGCTCTGCCC-3 ') de Operon Technologies et UBC109 (5'- TGTACGTGAC-3 ') de l'Université de la Colombie-Britannique, a produit trois bandes, deux THC et CBD une associée, une discrimination six ou sept paires de vracs ADN. La bande associée à la CDB (UBC109620 ) a été 620 bp, tandis que les deux associés à des marqueurs de THC (OPB06 1000 et OPA072100 ) ont été 1000 et 2100 pb. Les bandes RAPD discriminant les chémotypes au sein de chaque bloc sont présentés dans la figure 4 , a-c. Les associés-bandes chémotype ont ensuite été examinés dans la seule usine ADN comprenant les vracs. Les résultats sont résumés dans le tableau 5 .Marker OPA07 2100 semblait être le plus efficace car elle est présente dans toutes les usines de THC et dans seulement 2 des plantes de la CDB 61 examinés. Marker OPB06 1000 est tout aussi efficace pour les plantes THC, mais il a été détecté dans 6 des plantes de la CDB 61, ainsi. Marker UBC109 620 , CDB associés, est présent dans tous les F CDB 2 de l 'exception de 99.5.5, où seulement 1 usine de 9 constamment montré le marqueur. Le même marqueur est également présent dans 12 des 61 THCplantes examinées. En général, si l'absence d'association peut être attribuée à la recombinaison génétique entre le locus chémotype et le marqueur, puis le marqueur OPA07 2100 avait 1,3% de recombinaison, marqueur OPB06 1000 a 5,3%, et UBC109 marqueur 620 avait 10,3%, calculée comme moyenne de toutes les sept F 2 'art

Figure 4. Résultat de l'amplification médiée par les amorces RAPD trois OPA07, OPB06, et UBC109 (a-c) sur l'ADN en vrac de THC (T) et la CDB (C) des différents ségrégants F sept 2 's énumérés dans le tableau 5 . Les flèches indiquent les deux THC-(a et b) et la CDB-(c) des fragments d'ADN spécifiques. (D) L'amplification produite par le marqueur SCAR obtenus sur la base de la séquence du fragment spécifique THC montré en b; chaque couloir montre le résultat de l'amplification de l'ADN des plantes isolées, le THC pur (T), la CDB pure ( C), ou mixte (H). M indique que le marqueur de poids moléculaire (-ko échelle 1; Life Technologies).

Tableau 5. associés à des marqueurs Chémotype

Les trois marqueurs ont été séquencés et différentes combinaisons de 20-mer des amorces spécifiques ont été construits sur la base de la séquence d'ADN et testés. Les meilleurs amorces ont été trouvés àêtre dérivée de la borne OPB06 1000 , à l'origine THC associés. Ce-région amplifiée de séquence (SCAR) marqueur, appelé B190/B200, a été testé sur toutes les plantes unique de la F 2 de l ' examen, le THC pur , pure de la CDB, ou hétérozygote CBD / THC, et sur tous les S 2 plantes de la croix parents d'origine. Le résultat de l'amplification d'ADN amorcée par des amorces B190/B200 (avant, 5'-TGCTCTGCCCAAAGTATCAA-3 '; inverse, 5'-CCACTCACCACTCCACCTTT-3 ') est représenté sur lafigure 4D . Le phénotype THC est associée à l'amplification d'une bande de poids moléculaire d'environ 190 pb, alors que la CDB pure plantes montrent une bande de 200 pb. plantes hétérozygotes montré que les deux fragments dans la plupart des cas, ce qui indique que ce marqueur a eu l' caractéristiques codominance même que le locus chémotype; ces plantes ont également montré une bande supplémentaire à poids moléculaire élevé ( 250 pb). L'efficacité du marqueur B190/B200 pour prédire le chémotype des plantes examinés dans ce travail sont résumées dans le tableau 6 . Fait remarquable, l'efficacité avec laquelle la concurrente apparition de deux marqueurs identifiés les chémotypes hétérozygote est de 95,3%. Ces valeurs ont été calculées sur la base des résultats des marqueurs dans 63 usines appartenant à la S 2 lignées pures, dans 39 usines différentes de la F quatre 1's, et dans 246 usines de la F différents 2 'art Les parties séquencé des fragments d'ADN générés par les amorces RAPD ont été trouvés à partager aucune différence significative d'homologie avec les séquences d'ADN publiées pour le THC et CBD synthases (NOS GenBank;. E55108/GI 18629739 et E33091 / GI 18623981 brevet en instance) .

Tableau 6. Liaison des chémotypes avec le marqueur B190/B200
DISCUSSION

Au sein des populations de cannabis, de grandes variations dans cannabinoïdescomposition et le contenu peut être trouvée parmi les plantes individuelles.Par conséquent, pour étudier l'héritabilité du caractère de chémotype, nous avons choisi d'utiliser pures, les lignes féminines avec fixe, chémotype pure. données RAPD a confirmé la réduction relative des la base génétique des plantes parentales en raison de cette stratégie (tableau 1 ). Dans le parentale S 2lignes, le pourcentage de la cannabinoïdes principaux (PC n ) variait de 84 à 98% de la fraction totale cannabinoïdes C tot . Pour la F1 99,3, 99,5, et 99,6 et pour leur F 2 enfants, la somme de la CDB et de THC atteint des proportions de 95% de C tot . Les fractions restantes sont composés de différents mélanges de la CBG, CBC, THCV, et CBDV. Le F 99,4 1 's et leurs F 2 descendants ont une plus faible proportion de la CDB + THC (91%). Cela était dû à une présence constante des quantités plus élevées de la CBG, une caractéristique héritée des deux parents de cette descendance.
L'uniformité de la F 1 et F chémotypes 2 ratios de ségrégation en évidence la présence d'un seul locus, qui est visée sous le nom de B , indiquant l'hérédité mendélienne simple des deux allèles, B D et B T , comme en témoigne cette étude. Le modèle propose que un CBD végétale pure a un B D / B D génotype au B locus, alors une usine de THC pur a une B T / B T génotype. F 1 et 50% de la F 2 plantes sont donc hétérozygotes B D / B T , avec les deux allèles codominants et donc être en même temps exprimé dans les hybrides. L'hypothèse de deux allèles à un locus a été acceptée par 2 tests pour tous les F 2de l 'examen ( Tableau 4 ). Ce modèle est d'accord avec l'hypothèse d'un héritage monogéniques exprimée par B écus et al. 1998 .
Il faut reconnaître que ces résultats peuvent également s'expliquer par l'hypothèse de deux loci en double, l'un codant pour une synthase de la CDB et l'autre pour une synthase THC, la cartographie ainsi que l'observation de près de rupture de liaison a été impossible dans les descendances étudiées. Une telle situation a été trouvé dans les différents cas de gènes du métabolisme secondaire où les membres de double codage pour les enzymes catalysant soit consécutifs métaboliques ou des réactions des mesures alternatives à partir d'un précurseur commun. Dans le maïs, une famille de quatre gènes dupliqués (BX2-5) a été montré à coder pour le cytochrome P450 monooxygénases dépendantes, chaque catalyser l'une des étapes consécutives de l'indole à 2,4-dihydroxy-7-méthoxy-1 ,4-benzoxazine -3-one (DIMBOA) de synthèse (F REY et al. 1995 ; G LAWISCHNIG et al. 1999 ). Chez Arabidopsis, les gènes codant pour différentes 2-oxoglutarate dépendante dioxygénase (AOP1-3) ont été identifiés comme responsables de la synthèse des différents glucosinolates; ces gènes carte pour la position et le même code pour les réactions de remplacement à partir d'un précurseur commun, conduisant à 3 - hydroxypropyle et-butényle glucosinolates 3 (K Liebenstein et al. 2001 ). Ces auteurs ont pu également identifier une recombinantes (RI) en ligne doté d'allèles nuls, l'accumulation de la 4-methylsulfinylbutyl glucosinolates précurseur. gènes AOP ont été considérés comme en double, plutôt que comme allélique, essentiellement sur la base de la présence d'un cluster de gènes candidats dans le génome d'Arabidopsis séquencé. D'ailleurs, peu d'homologie n'a été trouvée entre AOP et d'autres gènes, même si un 60-70% d'homologie de séquence a été trouvée parmi les composants de cluster. Dans le cas des gènes cannabinoid, cependant, bien que la possibilité de la présence de gènes dupliqués ne peut pas être écartée sur la base des expériences présentées, les conséquences d'un modèle avec locus dupliqués doivent être examinés. Si lignées parentales CDB effectué allèles défectueux au THC locus (THC / CBD-THC / CBD ) et les lignes de THC à la CDB locus ( THC / CBD-THC / CBD ), une étude analogue, chemotypically uniforme, F 1 aurait été trouvé, ainsi que la ségrégation même chémotypes dans la F 2 . Théoriquement le dépistage des populations à grande échelle devrait révéler l'existence de fixe dominant homozygote doublement ( THC / CBD-THC / CBD ), montrant deux cannabinoïdes: ces plantes ne doit pas séparer le autofécondation. Une telle situation n'a jamais été observée pendant plusieurs années du dépistage génétique et autofécondation dans les programmes de sélection. Suite de l'examen donne à penser que s'il y avait des chances d'une croix qui sépare les deux locus dupliqués, lechémotype GBC ( THC / CBD-THC / CBD ) doivent être observés plus fréquemment que ce qui a été effectivement observé. En fait, dans les populations où une fréquence élevée de tous les trois chémotypes se trouve, comme dans variétés haschich, les allèles récessifs de la CDB et de THC devraitse produire avec une fréquence significative et, en raison de la nécessité de cannabis outbreeds, devrait avoir une bonne chance de se produire dans le homozygote de l'État. Au lieu de cela, les plantes GBC ont été détectés chez les cultivars de fibres qui, selon un modèle à deux locus, devrait avoir une très haute fréquence de la CDB et de THC allèles. Par conséquent, même extrêmement basses fréquences de la CDB allèle devrait conduire à GBC fréquentes chémotypes, en raison de la quasi-absence de THCallèles en fibres de chanvre. À l'inverse, encore que quelques rapports de plantes isolées montrent le chémotype GBC (F OURNIER et al. 1987 ; G. G RASSI et V. G. V IROVETS , communications personnelles), ce qui suggère une très faible fréquence de ce chémotype, en dépit de l'observation selon laquelle les plantes portant les allèles défectueux subi aucune perte de vitalité (G. FOURNIER , communication personnelle).
Ces faits sont plus exposé de manière convaincante par la rareté d'une mutation B 0 allèle pour un enzyme défectueux à un seul locus. H ORKAY 1986 estimé le degré d'auto-fécondation in populations monoïques, comme les cultivars français dans lequel les plantes GBC ont été trouvés, à 20-26%, et il est donc concevable qu'une mutation, allèle inactif au locus B pourrait avoir prospéré grâce répétées et consanguinité fréquente jusqu'à se fixer dans quelques plantes.
Bien que basé sur des preuves négatives, il est de notre avis que le modèle d'un seul locus allélique régissant la synthèse de la CDB et THC explique mieux la distribution chémotype dans les populations de Cannabis.
Dans ces F 2 d 'où les ratios de ségrégation plus dévié de (la plus grande 01:02:01 2 valeurs), il est resté constamment en raison d'une sous-représentation des homozygotes CDB, peut-être un effet récessif d'une semilethal facteur vaguement associés au B D allèle. Pour le 99.3.34 F 2 , la viabilité des graines différentiel et la survie des semis pourrait expliquer la faible proportion d'homozygotes CDB. Les autres F 2 's avec plus 2 valeurs ont montré une perte négligeable de semences et plants. Le semilethal facteur pris dans ces descendances doit donc déjà être effective au cours de l'embryogenèse. Uneindication supplémentaire de la viabilité réduite de la B D / B D génotype est fournie par la chute spectaculaire de la fécondité dans les usines de la CDB pure lors de la sélection de ligne, un phénomène qui est généralement absente dans les lignées THC (données non présentées). Bien que l'on peut s'attendre à plus de fibres cultivars d'avoir le B D / B D génotype, au meilleur de notre connaissance il n'existe pas de rapports sur la viabilité et la fertilité réduite de ces souches, par comparaison avec les populations à haut-THC. Toutefois, seulement une ségrégation de la population pourrait fournir chemotypically bonne preuve d'un tel phénomène, comme tous les autres traits génétiques contribuant à la viabilité et la fertilité doivent être randomisés entre les groupes chémotype.
Dans trois des quatre F 1 descendances, le contenu de la CDB a été plus élevée que dans la CDB parentale ( Fig 2 ). Cela peut s'expliquer par le fait que la CDB lignées parentales, généralement issus de souches de fibres, ont des valeurs faibles pour P flor et C tot (voir l'équation 1 ). Ces composants, polygénique dans la nature, montrent un fort effet hétérosis, par conséquent, le B D allèle de F 1 est actif dans les plantes beaucoup plus productive que celle environnement génétique dans les lignées parentales. Cela ne vaut pas pour les B T allèle, qui vient déjà de la drogue avec des souches de haute P flor et C tot valeurs.
Lorsque vous travaillez avec les jeunes, les matériaux végétatifs, les mécanismes moléculaires des marqueurs décrits peuvent être plus efficaces que les chromatogrammes GC dans le génotypage des plantes pour leur chémotype. Les marqueurs RAPD initialement identifiés ont été complètement dominante, comme prévu à partir d'une PCR marqueur, mais le B190/B200 marqueur, l'un des marqueurs SCAR développés sur la base des informations de séquence, se comporte codominantly ( figure 4D ).Les deux types de marqueurs apparaissent étroitement liées à la chémotype dans les pedigrees examinés jusqu'ici ( tableau 5 et tableau 6 ). Le marqueur B190/B200 pourraient être mises à profit dans letravail de sélection, mais à l'heure actuelle nous n'avons pas de données sur son utilité au-delà des Les croisements réalisés dans cette étude. Le marqueur semble particulièrement approprié pour distinguer la CDB pure et hétérozygotes plantes, qui peuvent être très utiles quand counterselecting pour le THCchémotypes dans l'élevage fibres de chanvre.
La synthèse de THC et CBD de plants de cannabis a été décrite comme une oxydo-réduction couplée à une cyclisation de la CBG, catalysée par une teneur en THC et un synthase CDB, respectivement. A synthase CBC a également été décrite, catalyser une réaction similaire conduisant à CBC. Ces enzymes ont été isolées de différents médicaments ou de la fibre souches, et beaucoup de leurs caractéristiques ont été élucidées. La plupart des propriétés de la CDB et synthase THC étaient très similaires, comme la masse (75 kD), l'existence comme un monomère localisée dans le cytosol, le pi, le pH optimum, la constante de vitesse k cat , la V max , et le K m pour leur substrat. En outre, le NH 2 -terminale des séquences des deux synthases partagé 87% de l'identité (T AURA et al. 1995 , T AURA et al. 1996 ). Les propriétés décrites pour la synthase de Radio-Canada (M Orimoto et al. 1998 ) Ont été tout à fait différente; cette enzyme a montré une plus faible K m(23 μ M au lieu de 134 et 137 μ M des deux autres synthases), un chiffre d'affaires nombre moins élevé (k cat = 0,04 s -1 contre 0,19 et 0,20 de la CDB et le THC synthase). On peut supposer que chacun des allèles identifiés dans ce travail, à savoir , B D et B T , code pour une isoforme de la même enzyme, la spécificité montrant pour la conversion de la CBG à la CDB , ou THC, respectivement. Dans l'état hétérozygote, les deux isoformes seraient présents et donc à la fois les conversions se produirait, en conformité avec les chémotypes mixtes observées dans la F 1 's et dans la moitié de la F 2 plantes.Cette hypothèse, présentée ici pour la première fois, est également soutenu par la récente publication de la séquence d'ADNc de la CDB et synthases THC, les deux séquences de 89% d'identité action, et la plus longue période sans correspondance est de quatre nucléotides. Le fait que, selon T AURA et al. 1995 , T AURA et al. 1996 , Les deux ont les mêmes affinités synthases très pour la CBG, théoriquement, devrait entraîner des ratios THC CBD près de 1,0 en B D / B T génotypes. Il est curieux que les différentes combinaisons parentales examinées dans nos différentes expériences montrent CBD / ratios de THC dans le F résultant 1 hybride, souvent fortement divergentes de 1,0 et assez stable hérité par le F 2 hétérozygotes ( tableau 3 ). Certains des facteurs héréditaires semble affecter l'équilibre entre la CDB et synthase THC dans leur concurrence pour convertir le précurseur GBC. Si ce facteur été à un locus différent, la ségrégation pour la CDB / THC dans la F 2 de l 'doivent être respectées. Toutefois, comme le montre la figure 3 , dans un F 2 descendance il n'ya pas depreuves de plusieurs grappes distinctes hétérozygotes avec des pentes . Il est donc possible que B D etB T font partie d'un plus large série allélique, codant pour plusieurs formes isoenzymatiques de la CDBsynthase et synthase THC, respectivement, avec des affinités différentes pour le substrat GBC, ce qui entraîne significativement différents ratios THC CDB hétérozygotes. Lorsque les deux parents sont homozygotes sont croisées, l'une avec une isoforme de certains synthase CDB, l' autre avec une isoforme de certains synthase THC, la CDB / THC dans la F 1 de l 'dépendra de l'équilibre entre l'efficacité des deux synthases et restera fixé dans n'importe quelle autre hétérozygote descendant obtenues par autofécondation.
Les données obtenues dans ce travail ne tiennent pas compte de l' héritage de la conversion de la CBG dans CBC. En principe, il est possible de supposer l'existence d'un allèle en outre, B C , à la B locus, codant pour une synthase CBC (M Orimoto et al. 1998 ), Mais aucune preuve directe est disponible et il ya la possibilité qu'un locus différents pourraient être impliqués. synthase CBC a été initialement isolé à partir d'un stade juvénile d'une souche de la CDB, et encore il s'est avéré très difficile d'obtenir des plantes CBC pure, même si les plantes atteignent des proportions CBC jusqu'à 64% du total des fractions cannabinoïdes ont été signalés (H Olley et al. 1975 ).
Le modèle de la biogenèse des cannabinoïdes avec ses relations entre les allèles et chémotypes résultant est illustré sur la figure 5 . Dans ce schéma, il est supposé que la voie menant à la CBG ou CBGV est régie par au moins un locus allélique, appelé A , sur lequel les expériences présentées ici ne donnent aucune information. Toutefois, il existe des preuves de l'existence de "null" génotypes à la Une locus, conduisant à des plantes dépourvues de cannabinoïdes; phénotypes tels ont en effet été observé (VG VIROVETS et G. G RASSI , communication personnelle). Les voies présentées sont cohérentes avec l'hypothèse de S HOYAMA et al. 1984 que le synthases caractérisés à ce jour permet de convertir tout aussi bien à la fois la CBG et CBGV dans les produits finis THC (V) et la CDB (V). Cette hypothèse est également soutenue par notre observation selon laquelle des traces CBDV ont été détectésseulement chez les homozygotes CDB ( B D / B D ) et des hétérozygotes ( B D / B T ), alors que lestraces THCV eu lieu exclusivement dans les homozygotes THC ( B T / B T ) et hétérozygotes (données non présentées).

Figure 5. Le modèle génétique présenté postule l'existence de deux locus distincts, A et B . Locus Apossède deux allèles différents A Pr et A Pe , responsable de la synthèse de l'une ou l'autre propyle ou la forme de pentyle cannabigerol (CBG ou CBGV, avec R 1 =-C 3 H 7 et R 2 =-C 5 H 11 ) . Locus B a allèles différents, chacun responsable de la conversion de la CBG (V) dans les produits finis de la CDB (V) et du THC (V) qui s'accumulent dans les inflorescences. Le B 0 codes allèle pour une enzyme non fonctionnelle, ce qui conduit à la CBG (V) accumulation. Tous les cannabinoïdes sont établis dans leur forme neutre.

Dans les matériaux étudiés, la proportion de la CDB et de THC atteint, au mieux, 96-98% de la fraction totale des cannabinoïdes. En général, même après cinq cycles de consanguinité de sélection visant à une cible de cannabinoïdes, au moins une impureté 2-4% constitué d'autres cannabinoïdes reste. Par conséquent, les allèles postulé ici, même dans les génotypes homozygote, semblent avoir une imparfaitecontrôle sur les événements de biosynthèse. Apparemment, l'une des formes isoenzymatiques postulé codées par les allèles au B locus montrent une capacité résiduelle pour convertir le précurseur GBC (V)dans d'autres cannabinoïdes que le plus important.
L'existence d'un seul locus déterminant le chémotype, avec au moins deux allèles, donne un sens clair génétiques de la tripartite de distribution de l'chémotypes au sein des populations, comme observé par plusieurs auteurs lors de la CDB vs parcelles teneur en THC sont considérés comme des(F OURNIER et P ARIS 1979 ; F OURNIER 1981 ; DE M EIJER et al. 1992 ). Selon notre modèle, ces parcelles ne sont pas seulement montrer la distribution des phénotypes, mais ils visualisent l'allèle de fréquence dans une population. Il devrait être possible d'étudier les fréquences de la B D et B Tallèles et leurs évolutions au cours du temps en fonction de la structure de la population, l'action desconditions environnementales, et les valeurs de remise en forme différentes réalisées par eux. Une autre conséquence du fait que la CDB vs THC parcelles sont en réalité à prendre en compte la distribution des parcelles allèle est que pas d'obstacles entre les différents chémotypes du cannabis peut être postulée.Les plantes qui sont distribués différemment dans un CDB vs parcelle THC n'ont pas de grandes différences génétiques, seulement différents allèles à un locus unique. Par conséquent, les plus couramment pratiquée application de chémotype comme critère taxonomique est très discutable.Probablement un caractère polygénique, tels que la teneur totale en cannabinoïdes, est mieux équilibrée et conservés dans les populations et est donc un critère plus robuste avec laquelle de taxons sub discrimination.
Dans le travail présenté ici, la stratégie de réversion du sexe partielle de plantes femelles a été utilisée pour obtenir S 2 , F 1 's, et F 2 de l '; encore les résultats obtenus devraient également vrai si dioïquesplantes avaient été utilisés comme parentals ou F 1 plantes ont été croisées pour obtenir la ségrégation F2 'art Le modèle proposé ici est donc hautement prédictifs et vise à stimuler de nouvelles recherches: il fournit un outil pour élucider l'existence éventuelle d'autres loci génétiques régulant la composition des cannabinoïdes.


NOTES
1 Adresse actuelle: GW Pharmaceuticals plc Science., Porton Down Park, Salisbury, Wiltshire SP4 0JQ, Royaume-Uni.


REMERCIEMENTS
Nous tenons à remercier la sélection végétale et chimie analytique de l'aide Tina Ent (Horta Pharm BV) et Kathy Hammond (GW Pharmaceuticals plc.) pour la révision du texte. Ce travail a été financé en partie par le ministère italien de l'Agriculture et des Forêts dans le cadre du projet «d'induction de marqueurs phénotypiques et l'amélioration du chanvre commun. "
Manuscrit reçu le 23 avril 2002; Accepté pour publication Octobre 16 mai 2002.


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[smooth]

13ème Fiche:

THC (tétrahydrocannabinol) accumulation dans les glandes de cannabis (Cannabaceae)
Paul G. Mahlberg et Kim Soo Eun, Département de biologie, Université de l'Indiana, Bloomington, IN USA, et Département de biologie, Université Konkuk, Séoul, Corée

INTRODUCTION

THC (delta 9-tétrahydrocannabinol) est connu pour être présent dans les plantes en fleurs de cannabis. Toutefois, son emplacement dans la plante et en particulier dans la cellule reste généralement moins connu. Nos études ont été dirigées pour déterminer ou sont localisés ces composés au niveau de la plante dans son ensemble ainsi qu'au niveau cellulaire, avec un objectif à long terme afin de déterminer "l'organelle" ou la membrane de la cellule dans leur synthèse. Il devrait également être possible d'identifier le gène responsable de la synthèse de ces composés, le THC, en particulier, et de moduler ce gène afin de développer des souches de cannabis sans THC, ou pas de cannabinoïdes. De telles souches seraient destinées à l'agriculture de chanvre.

La première phase de cette étude est de déterminer la localisation du THC dans la plante. Dans le cadre de ce programme nous avons entrepris un effort pour rassembler une collection de matériel génétique dans le monde entier avec différentes souches de la distribution qui sont utilisées dans la culture du chanvre au sens classique du terme avec aussi bien des graines que de l'huile de ces variétés et avec différents niveaux de THC. Nous avons utilisé ces souches pour des analyses de cannabinoïdes et leur distribution; ils serviront également comme source de matériel génétique pour de prochaines études.

Les objectifs de cette étude sont les suivants: a) pour déterminer où sont localisés les cannabinoïdes dans la plante, et dans quel tissu spécifique, b) pour déterminer où dans la cellule ou le tissu les cannabinoïdes sont localisés. Des études préliminaires montrent qu'il est dans la glande (ndlr trichome glandulaire). Historiquement, il a été rapporté qu'un mutant sans glande a été détecté à un moment donné, mais il est maintenant perdu. Si le THC est dans la glande et que des mutants sans glandes peuvent être produit, il devrait alors être possible de réduire sensiblement la teneur en THC de la plante. Une telle plante, avec une faible teneur en THC, serait une souche potentiellement importante pour l'industrie chanvrière.

MATERIELS ET METHODES

Pour les études de localisation, une souche plus concentrée en THC (6%) était typiquement employée, bien que certaines phases de comparaison aient été faites entre une variété à faible teneur en THC ou de la fibre de chanvre, et une possédant un niveau intermédiaire de THC.

Les plantes ont été cultivées à partir de graines dans une serre. La floraison des plantes a été développé en les soumettant à des jours courts (8h d'éclairage/jour) en recouvrant d'un drap noir. Les plantes ont été maintenues dans un état végétatif en rallongeant la durée du jour à 16 heures ou plus grâce aux éclairages artificiels (Hammond et Mahlberg, 1973).

Les données sur les comparaisons morphologiques ont été obtenues à partir de populations de plus de 10 plantes maintenues dans des conditions spécifiques. Depuis que les plantes obtenues à partir des mêmes sources de semences ont été cultivées plusieurs fois sous ces conditions, nous avons eu plusieurs fois l'occasion d'examiner les caractéristiques morphologiques au cours de nos études. Ces caractéristiques examinées comportent la germination des semis, la morphologie des feuilles, les caractéristiques florales des deux sexes, pistil (femelle) et staminées (mâle), caractères individuels pendant la floraison, les glandes et les poils sur les feuilles et les bractées florales à tous les stades de développement (Hammond et Mahlberg, 1977, 1978; Kim et Mahlberg, 1991; Mahlberg, et al., 1984; Mahlberg et Kim, 1991, 1992).

La contenance en phénol des glandes et autres tissus ont été examinées par chromatographie sur couche mince (CCM), chromatographie en phase liquide gazeuse, la spectroscopie de masse (GC-MS) et spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN), et les terpènes ont été analysés par GC-MS (Hammond et Mahlberg, 1992, 1990, inédit).

Pour la chromatographie en phase gazeuse (GC) des échantillons pesés de matériel foliaire au même stade dans le développement chez différentes plantes, des échantillons pesés de bractée ou d'autres matériels florals à des stades similaires de développement, des ensembles du contenu des glandes ou seulement des sécrétions de la cavité non cellulaire de la glande ont été extraits à l'éther ou avec du chloroforme et évaporée à sec. Les échantillons ont été redissous dans une quantité donnée d'alcool absolu contenant l'étalon interne, l'androstènedione (1 mg/ml), et injecté sur la colonne GC. Les analyses ont été réalisées sur une imprimante Hewlett-Packard 5710A chromatographe équipée d'un détecteur à ionisation de flamme d'hydrogène et programmé de 200 à 240°C (2°C/min). De l'azote (20 ml/min) a été utilisé comme gaz porteur. Les temperature du port d'injection et du détecteur étaient respectivement de 250 et 300°C. Les colonnes de verre ont été emballés avec 3% OV-1 Supelcoport (80/100 mesh). Les données quantitatives ont été déterminées avec un intégrateur Hewlett-Packard (3380A) et les échantillons ont été comparés avec les normes cannabinoïdes obtenues de l'Institut national sur l'abus des drogues (Hemphill, accordeur et Mahlberg, 1980; Turner et Mahlberg, 1984; Turner, Hemphill et Mahlberg, 1980).

Toutes les tètes de glande ont été retirées individuellement de la surface des feuilles ou de la bractée sous une loupe binoculaire avec une micro-aiguille de tungstène et placées dans des flacons contenant du chloroforme pour extraire les cannabinoïdes. L'aiguille est rincée dans du chloroforme après la collecte de chaque glande pour éviter la contamination croisée entre les glandes collectées. Les échantillons de vingt et 100 glandes ont été recueillies pour différentes périodes d'échantillonnage et analysées par GC tel que décrit (Turner, Hemphill et Mahlberg, 1978).

Les contenus des cavités sécrétoires ont été obtenus par la micromanipulation de verre microcapillaires. Les bractées contenant de nombreuses glandes étaient montées sur un support spécial sous l'objectif d'un microscope. Les tubes microcapillaires, fabriqué avec un extracteur micropipette Knopf et le sol avec de la pâte de diamant pour une pointe hypodermiques, ont été montées dans un système modifié de manipulation Leitz sous un objectif de microscope pour sonder la cavité sécrétoire sans toucher ni endommager les cellules du disque. Les tubes microcapillaires avec le contenu des cavités sécrétoires ont été placés dans de petits tubes à essai rincé l'acétone contenant du solvant pour dissoudre le contenu et préparés ensuite pour l'analyse CG (Lanyon, Turner et Mahlberg, 1981; Turner, et Hemphill Mahlberg, 1978).

Pour la microscopie à balayage électronique, des bractées ou d'autres tissus ont été fixés dans une solution tamponnée de glutaraldéhyde, puis rincés dans une solution tampon et déshydratés passant d'une série éthanol à l'acétone et séché au point critique. Les échantillons ont ensuite été montés sur des porte-échantillons et examiné à 20 kV avec un microscope électronique à balayage Cambridge 250 (SEM) (Hammond et Mahlberg, 1973).

Pour la microscopie électronique à transmission (MET), des bractées avec des glandes ont été préparées par cryofixation-cryosubstitution haute pression pour la propriété anticorps du THC. Ces tissus ont été fixés sous cryo-conditions à la glutaraldéhyde, seul ou dans le glutaraldéhyde et le tétroxyde d'osmium, noyés dans la résine, sectionné et traités avec la sonde anticorps, colorés et examinés sous un TEM à 60 kV. Les anticorps monoclonaux pour le THC, obtenus auprès de Roche Diagnostic Systems, ont été préparé dans une ascite souris normalement utilisée pour le dépistage des abus de drogues chez humains. Nous l'avons mis au point un électron comme sonde microscopique. Les sections Anticorps articles ont été visualisées pour le THC avec la protéine-A liée de particules d'or (20-nm pour Jannsen, Belgique). Contrôles inclus coupes traitées avec l'anticorps seul, ou traités avec la protéine A-or seul (Kim et Mahlberg, 1997a). Pour les études de TEM de développement, des bractées à différents stades de développement ont été fixés à la glutaraldéhyde, post-fixé dans le tétroxyde d'osmium et noyés dans la résine. Les coupes fines ont été colorées par le citrate de plomb et examinées à 60 kV (Kim et Mahlberg, 1991, 1995, 1997b; Mahlberg et Kim, 1991, 1992).

RÉSULTATS ET DISCUSSION

Les cannabinoïdes et THC
Dans cette étude, nous allons examiner deux types parmi plusieurs glandes du cannabis, les formes sessiles et pétiolées. En plus de cela, il y a des poils sur la surface de la plante. Dans notre commentaire, nous feront référence aux cannabinoïdes comme catégorie générale et specialisée de composés synthétisés par le cannabis. Les cannabinoïdes sont des dimères en ce sens qu'ils sont formés par assemblage de terpènes et de précurseurs du phénol (c).

Schéma 1 (ci-dessus). voie cannabinoïde. Les cannabinoïdes représentent un dimère constitué d'un terpène et un composant de phénol. Cannabigerol (GBC) est le premier composant de la voie. Il subit une transformation chimique pour former soit cannabichromene (CBC), ou cannabidiol (CBD). Delta 9-tétrahydrocannabinol (THC) est dérivé de la CDB.

Les cannabinoïdes incluent ces formes les plus abondante:

THC, delta 9-tétrahydrocannabinol

CBD, le cannabidiol

CBC, cannabichromene

GBC, cannabigerol

Un autre cannabinoïde, le cannabinol (CBN), est formé à partir du THC et peut être détecté dans certaines souches végétales. En règle générale, le THC, CBD, CBC et CBG sont produits ensemble dans des proportions différentes dans les diverses souches. Dans les souches à fibres, CBD / CBC sont en fortes concentrations tandis que le THC est à une faible teneur; dans les souches pour la drogue, la teneur en THC est élevée et les taux de CDB / CBC sont faibles. Un domaine important à étudier concerne l'apparition sur la plante d'un précurseur potentiel pour la formation des cannabinoïdes et où la synthèse se produit dans la cellule.

Répartition et types de glandes

Les glandes recouvrent entièrement les surfaces supérieures au dessus du sol des deux pieds femelles (femelle) et staminées (mâles), mais sont plus abondantes sur les bractées des plantes femelles (Fig. 1).

Figure 1. (Ci-dessus) Glandes sessiles et petiolés en dessous d'une bractée. Les poils sont aussi présents sur les bractées. x35.

Figure 2. (Ci-dessus). Glande pétiolées montrant grosse tête (étoile) et la zone d'abscission à la base de la tête de la glande (flèche). Les glandes sessiles sont évidents dans le fond avec une partie de poil. X300.

Légende pour tous les illustrations: C, cuticules; D, cellule de disque; P, plastes; S, matériel sécrétoire; T, cavité sécrétoire; V, vésicule; W, paroi cellulaire du disque.

Il existe deux types de glandes actives dans la sécrétion de cannabinoïdes sur les plantes femelles (fig. 1, 2):

a. Capitatum sessiles - le plus courant qui se rencontre sur les tiges, les feuilles et les bractées.

b. Capitatum pétiolées - se développe seulement après la formation des fleurs, et se rencontre surtout sur les bractées des fleurs et des semences. Les deux types sont présents sur la bractée sous-tendant la semence, mais certains facteurs qui stimulent la floraison stimulent aussi le développement de la tige liée à cette glande. Ainsi, cette glande a évolué du type sessile.

Une zone d'abscission se développe à la base de la tête où les cellules stipe attachées aux cellules du disque résultent de l'abscission des glandes arrivées à maturation (Fig. 2, flèche).

Cannabinoïdes, y compris le THC, composition des glandes

a. Effet de la position et la saison sur le contenu de la glande.

Nous avons analysé les deux types de glandes pour leur composition en cannabinoïdes. Toutes les glandes (20) ont été retirées des bractées et des feuilles de la même plante afin de comparer leur contenu. Ils ont été extraits et analysées pour les cannabinoïdes (tableau 1).

Nous avons aussi séparé ces même glandes selon qu'ils se trouvaient sur une veine ou bien une zone non-veineuse. Les résultats ont montré que les trichomes glandulaires pédonculées positionnés sur une veine de la bractée contenait plus de THC, environ 20 fois plus, que les trichomes sessiles positionnés sur la veine d' une feuille. De même, les trichomes glandulaires situés sur une zone non-veineuse contenaient beaucoup plus de THC que les glandes sessiles d'une zone foliaire non veineuse.

Étonnamment, même les trichomes glanduaires d'une bractée voyaient leur concentration en THC varier entre la veine et la zone non-veineuse. Nous avons également trouvé que les trichomes sessiles possédaient les mêmes variations de concentrations entre la veine et des zones non-veineuse de la feuille.

Ce tableau montre deux intervalles au cours de l'année, Octobre et Décembre, au cours desquels nous avons comparé les taux de THC dans les trichomes. Les comparaisons d'analyse du mois d'octobre avec décembre ont montré de nouveau que les trichomes glandulaires contenaient considérablement plus de THC que les trichomes sessiles. Pour les deux types cependant, les trichomes de la veine ont démontrés un taux moindre que ceux de la zone non-veineuse. Fait intéressant, le niveau de THC peut diminuer jusqu'à un niveau non détectable dans les trichomes(ceux des veines de la feuille).

Dans des analyses similaires de ces glandes sur d'autres souches nous avons trouvé le même modèle, mais les niveaux de cannabinoïdes dans les trichomes glandulaires n'étaient pas aussi élevés que pour cette souche. Dans cette variété, le prélèvement d'échantillon a été répété au cours de mois de Mars suivant, et de nouveau, les trichomes glandulaires sur la bractée affichaient des concentrations plus élevées en THC que les trichomes sessiles sur la feuille. Ainsi, un modèle reproductible semble se produire dans la plante dans laquelle les trichomes glandulaires contiennent généralement une plus grande quantité de THC que les trichomes sessiles.

b. Effet de l'âge sur le contenu des glandes cannabinoïdes

Nous avons également examiné le contenu cannabinoïde du trichome glandulaire avec l'age afin de mesurer les principales composantes cannabinoïdes, ceci à la fois dans les variétés cultivées pour la fibre et celle pour la production de drogue (tableau 2). Les trichomes, examinés sous microscope, peuvent être classés en fonction de leurs phases de sécrétion selon la couleur de leur contenu. Les trichomes les plus actif dans la sécrétion (adultes) sont en apparence translucides, les trichomes âgés sont de couleur jaune en apparence et ceux en sénescences sont de couleur brune. Les trichomes adultes étaient ceux qui avait les plus fort taux de leurs cannabinoïdes majeur, à la fois sur les variétés à fibre et les souches de pour la drogue. Les trichomes sénescents possédaient de faibles niveaux de cannabinoïdes. La concentration de certains composants, comme le CBD dans les souches pour la drogue, peut être si faible qu'il n'était pas détectable dans notre analyse; il en va de même pour le THC et CBN des la variétés cultivées pour la fibre de chanvre. Nous ne savons pas ce que deviennent les cannabinoïdes durant le processus de vieillissement, mais nous suggérons qu'il soit possible qu'ils se volatilisent dans l'atmosphère avec les terpènes dans les trichomes, comme il est indiqué plus loin dans ce rapport. Néanmoins, ce phénomène de contenu altéré dans les trichomes au cours du vieillissement devrait être étudié pour obtenir une compréhension plus complète du processus de sécrétion des cannabinoïdes dans la cellule.

Tableau 2. (Ci-dessus) Cannabinoide contenus dans les trichomes glandulaires d'âges différents.

C. Contenu de la cavité sécrétrice

La glande est constituée de cellules disques avec leur cytoplasme et d'un intervalle non-cellulaire de cavité sécrétoire. Nous avons examiné le contenu de cette cavité sécrétoire spécifiquement afin de déterminer si des cannabinoïdes se produisaient en elle. Avec des pipettes microcapillaires nous avons uniquement retiré le contenu de la cavité sécrétoire sans endommager les cellules du disque. Les données montrent que les cannabinoïdes sont abondants dans cette cavité (tableau 3). Chaque glande contient en moyenne 61 nanogrammes de cannabinoïdes. Cette souche était une forme de chanvre à teneur en CBD. Dans ces analyses chaque échantillon comprenait le contenu d'environ 100 glandes ou plus. Certains échantillons représentaient des bractées de longueurs différentes, allant de 4 à 9 mm, cette dernière étant la taille à maturité. Les échantillons de bractées de petitess taille, 4 mm., a montrée une variation de la teneur en cannabinoïdes par la glande, mais certains ont montré la plus forte teneur (échantillons 12 et 16) tandis que d'autres ont montré une faible teneur (échantillon 7). De même, des échantillons de bractées de grandes taille ont montrés une teneur relativement élevée (échantillon 6) ainsi que de faibles teneurs (échantillons 1 et 2). Certains échantillons ont également montré des ratios différents pour le CBD et le THC même si le taux global de cannabinoïdes était élevé (comparer les échantillons 12 et 16).

Tableau 3. Cannabinoides contenus dans les cavités sécrétoires des glandes des trichomes pétiolés d'une souche de chanvre montrant une teneur moyenne en cannabinoïdes.

Bien que ces différences puissent être attendues dans des échantillons biologiques, il souligne également que le composant cellulaire qui synthétise les cannabinoïdes ne peut pas les synthétiser dans un rapport constant au cours du développement d'un organe.

Résumé:

a) Les glandes des trichomes pétiolées contenaient plus de THC (et de cannabinoïdes au total) que les glandes des trichomes sessiles.

b) la quantité de THC et de cannabinoïdes en général, peut dans les deux types de glandes varier au cours de l'année et diminuer jusqu'à un niveau très faible.

c) Les cannabinoïdes se réduisent avec le vieillissement des glandes.

d) Les cannabinoïdes se produisent dans la cavité sécrétoire de la glande.

Lieu des cannabinoïdes dans la glande

a. Développement de la glande.

Pour les deux types de glandes agrandit une des cellules épidermiques et se divise plusieurs fois pour former une couche de cellules disque sur un stipe court sur l'épiderme de la feuille ou de la bractée (Diagr. 2).

Diagramme 2. (Ci-dessus). Représentation de la glande sécrétrice d'âge mûr. cellules du disque, attaché à la feuille ou de la bractée par les cellules et les cellules basales stipe (ci-dessous stipe), mur fibrillaire communiqué la matrice dans la cavité sécrétoire où elle contribue à l'épaississement de la paroi sous-cutanée (mur) au cours de l'élargissement de la cavité sécrétoire. Plastes (P) dans les cellules du disque produisent des sécrétions qui s'accumulent membrane plasmique à l'extérieur, passer à travers la paroi cellulaire comme des zones hyalines pour former des vésicules de sécrétion (L) dans la cavité sécrétoire. Vésicules en contact avec subcuticulaire contenu communiqué mur pour contribuer à la croissance de la cuticule au cours de l'élargissement de la cavité sécrétoire. THC se produit dans les murs, la matrice et d'autres contenus fibrillaire entourant les vésicules, mais pas dans les vésicules; peu de THC est présent dans les cellules du disque. Nucleus = noir; vacuole = V; vésicules = L; plastes = P; = réticulum endoplasmique ER.

La paroi externe des cellules du disque se divise tangentiellement à ouvrir une cavité intrawall dans le haut de la surface de la glande entière. Cela augmente les sécrétions cavité sont accumulés dans le (Fig. 3).

Figure 3. Section où la cavité sécrétoire rejoint disque cellule montrant la cuticule et la paroi sous-cutanée, des vésicules de sécrétion dans la cavité, les sécrétions dans la cellule juste au-dessous du disque de la paroi de la cellule de disque qui la sépare de la cavité sécrétoire. Bar = 0,5 microns.
La partie extérieure de la paroi reste associé à la cuticule pour former la paroi sous-cutanée, la partie intérieure reste associée aux cellules du disque. Tant les cuticules et d'augmenter l'épaisseur sous-cutanée mur que de l'élargissement de la cavité de sécrétion et, par conséquent, des précurseurs pour la croissance doivent être présents dans la cavité de sécrétion. Les sécrétions des vésicules sont évidents dans la cavité sécrétoire. Note les vésicules sont semblables en densité (grisaille) aux sécrétions gris dans la cellule du disque. Le mécanisme qui contrôle l'épaississement de la cuticule et la paroi sous-cutanée sont pas encore connus.

b. rôle de sécrétion des cellules du disque

Il est pertinent d'examiner l'organisation des cellules du disque parce que tous les contenus dans cette cavité doit être dérivées des cellules du disque. Les cannabinoïdes, ou de leurs précurseurs, sont des sécrétions de ces cellules. Un autre groupe important de composés sécrétés sont les terpènes (monoterpènes et sesquiterpènes). Monoterpenes sont les plus abondantes des deux. Terpènes composent les huiles essentielles », ils contribuent à l'odeur de la plante, et sont de nature collante, comme il ressort quand on touche la plante. Différentes combinaisons de terpènes dans les différentes souches de contribuer à l'odeur des différences entre les souches. Cannabinoïdes, et du THC, sont inodores à la plupart des êtres humains.

Figure 4. Portion de la glande montrant les cellules du disque, chacun possédant lipoplasts nombreuses. Portion de la cavité sécrétoire est évident. Matrice fibrillaire s'est séparé de la paroi (flèche). Bar = 0.5μm.
Le niveau des cellules disque contient une cellule typique de compléter, y compris un gros noyau, plastes, les mitochondries, le réticulum endoplastic et des ribosomes abondants, ainsi que des vacuoles (Diagr. 2; Fig. 4). Plastes, cependant, représente la composante unique de ces cellules. Ils sont interprétés comme une source, peut-être la principale source, des sécrétions dans la cavité. Plastes se diviser et deviennent très nombreux dans les cellules du disque. Plastes forme une composante centrale inhabituelle, appelé le réticulé corps, provenant de thylakoïdes (fig. 4, 5). Cet organe se compose de thylakoïdes fusionnés en un faisceau tubulaire de zones claires et sombres dans un arrangement hexagonal. Ce grand corps est un peu comme un corps prolamellaires qui se forme dans les chloroplastes lorsque les plantes sont cultivées dans l'obscurité parce qu'il a une configuration réseau similaire à un organisme prolamellaires. Mais c'est la différence d'un corps prolamellaires en ce qu'il persiste à la fois la lumière et l'obscurité, et il ne contribue pas à la formation des membranes grana comme le fait le corps prolamellaires.

Figure 5. présence de la sécrétion Lipoplast montrant sur sa surface et de la région où la sécrétion rejoint le corps réticulé (flèche). Bar = 0,2 microns.
La réticulée corps a été associée à l'activité sécrétoire. quantités Chambre de sécrétions accumulées sur la surface de la plastes, et étaient en continuité avec la zone de lumière dans le corps réticulé (fig. 5). L'association de la masse sécrétée par la zone de lumière sur la surface du plaste appuyé une interprétation selon laquelle le corps réticulé contribue à la synthèse de ces sécrétions (Fig. 5, flèche). Ces sécrétions sont visibles sur presque tous les plastes et peuvent devenir trop volumineux pour entourer un plaste, tel qu'il apparaît dans un microscope électronique. Ces sécrétions sont plus ou moins rondes en apparence dans ces sections, mais sans doute sphérique en trois dimensions; car ils sont huileuse dans la composition, ils forment des masses sphériques dans le milieu aqueux de la cellule. Ces sécrétions sont interprétés comme des terpènes; plastes dans d'autres usines sont déclarés à produire des terpènes.

Figure 6. membrane plasmique près Lipoplast (flèche). Portion de la sécrétion en contact avec et en passant à travers la membrane plasmatique (flèche). Il s'accumule entre la membrane et la paroi cellulaire. Bar = 0,1 microns.
Les sécrétions à la surface de plastes peut être observée en contact avec la membrane plasmique (fig. 5, 6). De même, les autres quantités de sécrétions de même densité, mais pas en contact avec un plaste d'une lame mince, ont été observées en contact avec la membrane plasmique (fig. 3, 7).

Figure 7. Sécrétions (zones petite lumière dans le mur) apparaît comme une vésicule (V) dans la cavité sécrétoire (T). Matrice fibrillaire (flèche) semble être sorti de la paroi dans la cavité sécrétoire. Dans la cellule du disque, les sécrétions sont évidents dans le cytoplasme adjacent à la membrane plasmique et à la surface de lipoplasts. Bar = 0,2 microns.

Sécrétions dans la cavité sécrétoire

Sécrétions en quelque sorte à travers la membrane plasmique et accumulés dans l'espace compris entre la membrane plasmique et la paroi cellulaire (Fig. 6, flèche et S). Sécrétions par la suite passé à travers la paroi cellulaire, souvent sous la forme de petites zones de lumière dans le mur (fig. 3, 5, 6).

Sécrétions émergé dans la cavité de sécrétion que les plus petites accumulations sur la surface du mur face à la cavité (fig. 3). Petites vésicules gris, partiellement encastré dans le mur, à l'ouest et au bas à gauche de la grande vésicule (V), près de l'angle »de la cavité sécrétoire. Ils ont la même densité de gris que les sécrétions dans la cellule du disque (Fig. 6). Il semble que le matériau passant à travers la paroi accumulés dans des vésicules élargie sur la surface du mur face à la cavité sécrétoire. Comme vésicules sortir de la cavité ils sont devenus entouré d'une surface d'environ Ω fonction de l'épaisseur d'une membrane typique (fig. 3, 7).

Les vésicules sont libérés de la surface du mur de regrouper dans la cavité sécrétoire (Fig. 8). Ces vésicules sont transportées à la surface de la paroi sous-cutanée, où certains d'entre eux sortent leur contenu dans le mur (Fig. 8, flèche courbe). Le contenu a également déplacé à travers la paroi sous-cutanée à la cuticule, où le contenu assistée par un épaississement de la cuticule (fig. 3, 8). Le contour irrégulier de la surface interne de la cuticule foncé extensions fibre comme dans la cuticule, est dérivé de la fusion des quantités de matières vésiculeuse du porc avec sa fonction de surface environnantes.

Figure 8. Gaine extérieure de la cavité de sécrétion de la cuticule se compose et le mur sous-cutanée. Vésicules (zones claires) sont évidents dans le mur subcuticulaire (flèche courbe). Vésicules et fibrillaire de la matrice sont évidentes dans la cavité. Bar = 0,1 microns.
Matrice fibrillaire est libéré de la surface de la paroi dans la cavité sécrétoire. Cette matrice est évident à ce mur, ainsi que dans la cavité de sécrétion (fig. 4 arrow, 7 flèche). La matrice fibrillaire est transporté vers le mur où il devient sous-cutanée constituée contribuant ainsi à l'épaississement de ce mur. Les mécanismes qui contrôlent le dépôt de matrice fibrillaire dans le mur sous-cutanée, ainsi que le dépôt de matières vésiculeuse du porc dans le mur sous-cutanée et la cuticule, restent à étudier. Étant donné que les sites de dépôt sont très éloignés de l'origine de ces matériaux, nous supposons que le mécanisme de contrôle réside en quelque sorte dans la cavité non-cellulaires de sécrétion.

Résumé:

a) Les plastes produire une quantité importante de sécrétions qui sont libérés de leur surface de passer à travers la membrane plasmique et la paroi extérieure dans la cavité sécrétoire.

b) Les sécrétions s'accumulent dans la cavité de sécrétion de vésicules de sécrétion dont le contenu contribue à l'épaississement de la cuticule.

c) Les composés volatils des vésicules de sécrétion peuvent se volatiliser dans l'atmosphère et contribuent odeur des plantes.

d) matériel fibrillaire de la matrice et d'autres libérés de la surface du mur entourent les vésicules de sécrétion d'une fonction de surface de composition inconnue encore.

Matrice fibrillaire contribue à l'épaississement de la paroi sous-cutanée.

Localisation de THC dans la glande

Bien que les cannabinoïdes ont été détectés dans le contenu isolé de la cavité sécrétoire, nous ne savons pas encore si elles se produisent dans les cellules du disque. En outre, nous ne savons pas encore où ils sont dans la cavité sécrétoire: dans ou autour des vésicules, ou ailleurs dans la cavité.

Pour cette phase de l'étude des glandes fraîches ont été gelés par cryofixation haute pression, puis fixée (tués) par cryosubstitution pour empêcher le mouvement de THC dans la glande pendant le processus de fixation. Nous avons préparé un anticorps monoclonal pour le THC comme une sonde en attachant des particules d'or de façon à ce qu'il serait visible au microscope électronique. Ensuite, les lames minces des glandes ont été traités par la sonde d'anticorps, les anticorps se joindre à n'importe quel THC dans le tissu. Au microscope électronique, nous verrons l'électron des particules d'or dense, plus dense des points noirs, où l'anticorps est fixé au THC.

En examinant les tissus, nous constatons que le THC, comme indiqué par l'emplacement des particules d'or, est présent dans la paroi cellulaire face de la cavité sécrétoire (W), et dans la paroi sous-cutanée (grande flèche) en vertu de la cuticule (Fig. 9) . Elle est également présente dans la matrice fibrillaire d'être libéré dans la cavité de la paroi cellulaire du disque (flèche). Il a été le long de la fonctionnalité de surface (flèche petite) entourant les vésicules de sécrétion importante dans la cavité. Il a également été dans la cuticule (flèche).

Figure 9. (Ci-dessus) Sites de l'accumulation de THC sont évidents comme des points noirs représentant de l'or fixé à l'anticorps de THC. THC est présent dans la paroi cellulaire du disque (W), mur sous-cutanée (grande flèche), ainsi que les caractéristiques de surface autour des vésicules dans la cavité (tête de flèche de petite taille), dans la matrice fibrillaire d'être libéré de la paroi cellulaire du disque (flèche) et dans le cuticule (flèche). Aucune particule étaient évidents en dehors de la glande. Bar = 0,2 microns. Figure 10. Le THC est abondante le long de la caractéristiques de la surface (flèche) des vésicules nombreuses dans la cavité de sécrétion, mais absent du contenu dans les vésicules. Lorsque la fonction de la surface d'une vésicule est sectionné en vue de la surface, le THC apparaît sur toute la surface. Bar = 0,1 microns.

Au fond de la cavité nous constatons, encore une fois, que le THC a été associée à la fonction de surface autour des vésicules de sécrétion de nombreuses, mais ce n'était pas à l'intérieur des vésicules (Fig. 10 flèches). Quelques vésicules ont été coupés avec leur caractéristique de surface en vue plane (aspect légèrement gris), et des grains d'or sont associées à la zone de la fonctionnalité de surface. Le contenu de ces vésicules (espace libre), sans doute, sont les monoterpènes (matériaux lipidique).

Étonnamment, il n'est pas dans le cytoplasme des cellules du disque (Fig. 9). Nous l'avons détecté que le long de la membrane plasmique et la paroi de la cellule bon disque. Seul un grain occasionnel a été détecté dans le cytoplasme, soit plus d'un plaste, mitochondrie ou ou parmi les ribosomes. Si les cannabinoïdes sont synthétisées dans le cytoplasme des cellules du disque, il devrait y avoir des particules d'or en abondance dans les sites de la synthèse et l'accumulation de THC.

Dans d'autres cellules, les cellules épidermiques, le THC était présent dans le mur, mais en plus petites quantités que dans les murs de la cellule de disque. Peu de particules d'or ont été dans le cytoplasme ou les vacuoles des cellules d'autres.

Contrôles inclus coupes traitées avec l'anticorps seul, ou traités avec la protéine A-or seul. Contrôles ne présentaient aucun anticorps dans la paroi cellulaire du disque, autour des vésicules, sous-cutanée dans la paroi ou dans la cuticule. Aucun anticorps a été détecté à l'extérieur des cellules.

site possible de la synthèse des cannabinoïdes

Nos études contribuent plusieurs pièces du puzzle de l'endroit où les cannabinoïdes sont synthétisés, mais nous manquons d'informations définitives sur le site précis de leur formation. Les données de la sonde d'anticorps montrant qu'ils ne sont pas évidentes dans le cytoplasme des cellules du disque suggèrent qu'elles peuvent être formés dans ou en dehors de la surface de la membrane plasmique. Un modèle de travail pour l'étude continue sur leur synthèse est incorporée dans le schéma 3.

Diagramme 3. (Gauche) Représentation de la glande illustrant le processus de localisation possible des cannabinoïdes dans la cavité sécrétoire. Un glucoside phénolique est transporté dans une cellule du disque et stockées sous forme de phénol libre dans la vacuole. Terpène est synthétisée par le plaste spécialisés, lipoplast, dans les cellules du disque. Ces précurseurs, terpènes et les phénols, réagissent pour former à la surface de cannabinoïdes membrane plasmique ou dans le mur de quoi ils apparaissent dans la cavité de sécrétion.

Tel que décrit dans la voie cannabinoïde, ces composés dimériques composé de terpènes et les composés phénoliques. L'abondante activité sécrétoire de la cellule de disque plastes, et sachant que cet organite ne synthétiser des terpènes, suggère qu'elles contribuent le composant de terpène. Notre détection, dans les études antérieures, de phénol abondantes dans les glandes ensemble, et les connaissances qui s'accumulent dans les phénols vacuoles des cellules, suggère que cette fonction cellulaire peuvent contribuer le composant phénol. Les phénols sont transportés dans la plante comme glycosides et, lorsqu'ils deviennent localisées dans une vacuole des cellules, ils s'y accumulent sur la dissociation de la fraction de sucre qui renvoie vers le cytoplasme des cellules.

Nous émettons l'hypothèse que les terpènes et les phénols, lorsqu'elles sont libérées de leurs sources respectives, s'accumulent à la membrane plasmique et la paroi cellulaire interphase lorsque des enzymes dimériser ces composés dans les cannabinoïdes. Il est nécessaire de déterminer les enzymes impliquées dans la synthèse des cannabinoïdes. Une telle enzyme, le cas échéant, peuvent être préparées comme une sonde anticorps qui peuvent être utilisés pour identifier plus précisément le lieu de cannabinoïdes, et de THC, la synthèse. Glandes représenter des structures uniques, et peuvent être utilisés pour élargir notre compréhension de la synthèse des cannabinoïdes et de l'aide dans nos efforts pour réduire la teneur en cannabinoïdes de variétés de cannabis pour la production de chanvre industriel.

CONCLUSIONS

1. Le THC accumulé en abondance dans la cavité sécrétoire où il a été associé à: a): des parois cellulaires), b) des éléments à la surface des vésicules de sécrétion, c) du matériel fibrillaire libéré de la paroi cellulaire du disque, et d) de la cuticule. Il n'a pas été associée avec le contenu des vésicules de sécrétion. L'association du THC avec des composants structurels, en particulier le mur, fibrillaire de la matrice et fonctionnalité de surface des vésicules, suggère qu'il peut être chimiquement lié à eux plutôt que d'être libre dans la cavité. Si le THC et autres cannabinoïdes sont liés à des composants dans la cavité, leur présence et le mouvement peut exiger une source d'énergie dans la cavité. Des études complémentaires sont nécessaires pour déterminer leur statut lié ou libre.

2. Peu ou pas de THC a été détecté dans le cytoplasme des cellules du disque. Ceci suggère que les terpènes et les précurseurs du phénol, qui doit avoir lieu dans les cellules du disque à un certain intervalle de temps, peuvent former des cannabinoïdes à la surface de la membrane plasmique, ou dans la paroi cellulaire face de la cavité sécrétoire.

3. Certains THC était présent dans les parois cellulaires d'autres cellules. Les gènes pour la synthèse des cannabinoïdes sont présents dans toutes les cellules de la plante, mais les tissus autres que les glandes produisent de faibles niveaux de ces composés.

4. la Réduction ou l'élimination des glandes par des procédures de mutation permettra de réduire considérablement la quantité de THC dans la plante. Cependant, la voie cannabinoïde de synthèse est contrôlée génétiquement: les glandes sont spécialisées dans la synthèse de niveaux élevés de cannabinoïdes. Ainsi, une plante dépourvue de trichomes on peut s'attendre à synthétiser de très faibles niveaux de cannabinoïdes. Nous ne savons pas le rôle des cannabinoïdes dans les glandes. Ils peuvent être impliqués dans un processus de «protection», ou un autre rôle. L'absence de glandes peuvent ou ne peuvent pas modifier le rôle fonctionnel. Depuis que d'autres cellules synthétisent également ces composés, à des niveaux très bas, la quantité peut être suffisante pour exercer le rôle fonctionnel. Par conséquent, un mutant dépourvu de trichomes devrait servir notre but de réduire la concentration en THC pour l'utilisation de ces souches dans l'industrie du chanvre.

REMERCIEMENTS

This study was supported with stipends from the Korean Ministry of Education through Research Funds, 97-BSRI-4441 (ESK) and the Indiana University Faculty Research Program (PGM). We appreciate the generous gift of THC antibody provided by Roche Diagnostic Systems, NJ. Drug Enforcement Administration registration number PI00433113 (PGM).

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[smooth]

Ok voila modification faite et en plus une petite fiche en plus
les prochaines mettrons un peu plus de temps
Bonne lecture a tous

14ème Fiche:

Relations entre les trichomes glandulaires et teneur en cannabinoïdes II.
Développement des feuilles végétatives de Cannabis sativa L. (Cannabaceae) *

PAR
TURNER JC, JK Mahlberg HF-MPHILL et PG
Département de biologie, Université de l'Indiana, Bloomington, Indiana, USA

* Cette étude a été financée par des subventions de recherche pour PG Mahlberg du ministère de l'Agriculture des États-Unis d'Amérique et le National Institute on Drug Abuse.

RÉSUMÉ

Gland nombre et la teneur en cannabinoïdes ont été quantifiées au cours de l'ontogenèse des feuilles végétatives de trois clones de cannabis. ouverture de glandes sessiles et capitatum-bulbe a été trouvé à se produire régulièrement au cours developinent feuilles. Les cannabinoïdes ont été synthétisés à travers le développement des feuilles ainsi, mais à un rythme décroissant. Une corrélation positive a été trouvée pour l'ensemble des glandes capitatum-sessiles par feuille par rapport à la teneur en cannabinoïdes total de la feuille. Les données indiquent également que d'autres tissus de feuilles en plus des glandes peuvent contenir des cannabinoïdes.


Introduction

Parmi les trois types de trichomes glandulaires présents sur Cannabis sativa, seulement deux (bulbe et capitatum-sessiles) sont présents sur les feuilles végétatives, tandis que capitatum pétiolées glandes se trouvent en liaison avec l'inflorescence (Harnmond et Mahlberg, 1973, 1977; Turner, Hemphill et Mahlberg, 1977, 197 . Les deux types de glandes capitatum ont été impliqués dans d'importants réservoirs de cannabinoïdes (Fujita et al, 1967; Fairbairn, 1972; DePasquale, 1974; Malingre et al, 1975;. André et Vercruysse, 1976; Turner et al, 1977, 197 . La feuille végétative, par conséquent, représente un système expérimental dans lequel un type de glande spécifiques capitatum peut être étudiés en relation avec les cannabinoïdes présents dans la feuille.

Des travaux antérieurs dans notre laboratoire a révélé que les trichomes glandulaires épidermiques présents sur le cannabis semble-il un système complexe et dynamique en ce qui concerne à la fois ontogénie glande et teneur en cannabinoïdes (Hammond et Mahiberg, 1973, 1977, 1978; Turner et al, 1977, 197 . Dans la première partie de l'étude actuelle (Turner, Hemphill et Mahlberg, 1981), une corrélation positive a été trouvée entre le nombre total des glandes capitatum et des cannabinoïdes total des bractées pistillées. En outre, les données suggèrent que les glandes sur une bractée pourrait contenir la teneur totale en cannabinoïdes détecté dans la bractée (Turner et al., 1981).

Le but de cette enquête est d'examiner le modèle de distribution glande ainsi que le profil des cannabinoïdes de feuilles végétative pendant toute l'ontogenèse de la feuille. Les résultats devraient indiquer dans quelle mesure les rapports entre les glandes et les cannabinoïdes trouve pour tenir compte de ces feuilles végétatives trouve pour bractées pistillées.


Matériels et méthodes

Clones

Les plantes de variétés de cannabis trois ont été sélectionnés et clonés (Turndr et al., 1977). Ces clones ont été obtenues à partir d'une haute delta9-tétrahydrocannabinol (Delta 9-THC) souche (152), un faible Delta 9-THC, le cannabidiol élevé (CDB) souche (79), et une souche haute de la CDB (87). Les clones ont été cultivés dans des conditions ambiantes à effet de serre.


Des parties de plantes échantillonnées

Certaines feuilles de chaque clone ont été analysés pour leur numéro de glande et teneur en cannabinoïdes. brochures Centre de feuilles composées de longueur croissante ont été recueillies à partir de plantes végétative. Longueurs comprenait 2,5 crn tracts (très jeunes) à 12,5 cm dépliants (matures) à intervalles de 2,5 cm. Dépliant échantillons ont été prélevés à la mi-Juillet et début Septembre 1979. Les données présentées dans les chiffres proviennent de la collection Septembre.


Chromatographie gaz-liquide (GLC) et microscopie électronique à balayage

Feuilles d'être analysées ont été recueillies à un moment donné de la journée (15 heures) et traitées comme décrit précédemment (Turner et al., 1977). Les analyses par GLC ont été réalisées sur une imprimante Hewlett-Packard 5710A chromatographe équipé d'un intégrateur HP 3380A. Les échantillons préparés pour microscopie électronique à balayage (MEB) ont été examinés avec une recherche automatique ETEC.


quantification Gland

Gland nombre par unité de surface sur les feuilles de comptage a été déterminée par les glandes directement sur l'écran SEM (Turner et al., 1977). Le prospectus, les chiffres ont été faites au milieu du limbe, de la nervure médiane de la marge. plusieurs chefs d'accusation (16 domaines, soit au total l mm2) à la fois la veine adaxial et abaxial ainsi que les zones non-veineuse ont été faites, et les résultats ont été moyennées pour fournir une moyenne de l'échantillon. Dans les expériences en cours, les zones non-abaxial veine sur les jeunes feuilles (de 2,5 à 7,5 cm) étaient trop densément couvertes de trichomes glandulaires non pour obtenir un décompte précis des glandes. Ainsi, pour des raisons de comparaison, toutes les données des valeurs pour la notice échantillons ont été en moyenne sans compter les chiffres des zones abaxial. Les données pour chaque échantillon la longueur des feuilles ont été calculés comme des glandes par mm2 et aussi que les glandes total par foliole. Pour la teneur estimée en cannabinoïdes des glandes individuels, les glandes compter sur les zones non-veine abaxiale des feuilles les plus âgées (10 à 12,5 cm) ont été inclus dans les calculs.


Résultats

Gland quantification sur des dépliants

A des intervalles de l'ontogenèse des feuilles, le nombre de chaque type de glande par rnm2 a été déterminée. Les données recueillies dans les deux Juillet et Septembre étaient essentiellement identiques. Aucun glandes capitatum pétiolées ont été observées sur les échantillons de feuilles.glandes sessiles-capitatum étaient non seulement présents à chaque étape du développement de la feuille de ces clones, mais aussi leur densité est demeurée relativement constante pendant toute l'ontogenèse des feuilles (figures I-III). Clone 152 en moyenne de 2 glandes sessiles-capitatum par mm2 (figure I), tandis que les clones 79 et 87 en moyenne de 5 glandes capitatum-sessiles par mm2 (chiffres II, III). glandes bulbe ont aussi été observées à des densités glande relativement stable à tous les stades de développement des feuilles de ces clones (figures I-III). Toutefois, la plus forte densité de la glande glandes bulbeuses ont été trouvés sur les clones 152 et 79, en moyenne 33 et 30 glandes bulbeuses par mrn2 respectivement (chiffres I, II) Clone 87 a été trouvé pour avoir une plus faible densité de glandes bulbeuses à 21 par mm2 (figure III).

Le nombre total des glandes capitatum-sessite par foliole a également été déterminés pour ces clones au cours du développement (figures IV-VI). Sur chaque clone, une augmentation du nombre total glande a été considérée comme la feuille développée, bien que les clones différaient dans les chiffres précis des glandes capitatum-sessiles trouvé (figures IV-VI). Clone 152 avaient moins de glandes à chaque stade de développement que les clones 79. Le nombre total des glandes capitatum-sessite par foliole a également été déterminés pour ces clones au cours du développement (figures IV-VI). Sur chaque clone, une augmentation du nombre total glande a été considérée comme la feuille développée, bien que les clones différaient dans les chiffres précis des glandes capitatum-sessiles trouvé (figures IV-VI). Clone 152 avaient moins de glandes à chaque stade de développement que les clones 79 et 87 (figure VII). Les clones 79 et 87 ont le même nombre de glandes, sauf sur des dépliants matures (12,5 cm) où clone 87 a un plus grand nombre de glandes capitatum-sessiles (figure VII).

Cannabinoid contenu de tracts

concentration de cannabinoïdes, sur la base du poids sec, a diminué dans chacun des clones pendant toute l'ontogenèse notice (figures VIII-X). Bien que les deux clones 79 et 87 caractéristique des niveaux élevés de la CDB, le clone 79 ans avaient des niveaux plus élevés de la CDB dans la plupart des stades de développement notice de clone 87 (figures IX, X), Clone 152, une souche de Delta 9-THC, avaient des niveaux de cannabinoïdes ( Figure VIII) comparables à des niveaux de cannabinoïdes trouve pour clone 87 figure (X). Les clones de chaque contenaient des concentrations de cannabinoïdes leurs caractéristiques à des niveaux similaires à la concentration totale cannabinoïdes détectés (figures VIII-X).


Exprimé sur une base par notice, les cannabinoïdes total a augmenté au cours de l'ontogenèse des feuilles dans chacun des clones (figures IV-VI). Les plus jeunes ainsi que les brochures les plus matures des clones contenaient des quantités similaires de cannabinoïdes (figure XI). Toutefois, aux stades intermédiaires, les clones 152 et 87 avaient de faibles quantités de cannabinoïdes de clone 79 (figure XI). L'augmentation des cannabinoïdes total par notice, en général, parallèlement à l'augmentation du total des glandes capitatum-sessiles par feuille pendant toute l'ontogenèse des feuilles (figures IV - VI).


La densité de trichomes glandulaires non diminué légèrement et à un taux similaire sur chaque clone que les tracts élargie (figure XII). Les clones 79 et 87 ont été trouvés à des densités comparables de trichomes cours de l'ontogenèse des feuilles. Toutefois, 152 clone avait environ 25 pour cent trichornes plus par unité de surface au cours du développement dépliant de 79 clone ou 87 (figure Xil).


Discussion

Végétative des feuilles de cannabis sont l'occasion d'étudier un type de glande capitatum (capitatum-sessiles) par rapport à la teneur en cannabinoïdes sans la présence de capitatum-grappes. Le schéma de répartition des glandes cours de l'ontogenèse des feuilles diffère considérablement de celle trouvée au cours du développement de la bractée pistillées (Turner et al, 1981). Les deux types de glandes présentes sur la feuille, capitatum-sessiles et bulbeux, ont été trouvés pour maintenir une densité relativement constant au cours du développement des feuilles sur chacun des clones. En comparaison, les deux glandes capitatum-sessiles et bulbeux sur les bractées de la densité a diminué au cours de l'ontogenèse des bractées. Dans quelle mesure, le cas échéant, l'apparition et l'augmentation de la densité de glandes pédonculées-capitatum au cours du développement des bractées influencé la diminution des glandes sessiles-capitatum est inconnue. Toutefois, sur les feuilles, en l'absence de glandes pédonculées-capitatum étaient présents, les glandes capitatum-sessiles n'a pas diminution de la densité cours de l'ontogenèse des feuilles. Les considérations qui interviennent dans la détermination des profils de la densité de la glande au cours du développement des feuilles et des bractées sont inconnus.

Bien que la densité des glandes de chaque clone est resté constant tout au long de développement de la feuille, les numéros spécifiques de chaque type de glande varie d'un clone à l'. Les clones 79 et 87, qui sont élevés dans l CDB, ont été trouvés à des densités plus élevées ont des glandes capitatum-sessiles de 152 clone qui contenait des niveaux élevés de Delta 9-THC. Que ce soit la densité de la glande de l'ontogenèse des feuilles est influencée par la caractéristique présente des cannabinoïdes dans une souche est inconnue. Toutefois, la présence de l'une des Delta 9-THC ou de la CDB que le cannabinoïde caractéristique ne semble pas avoir il un facteur important pour déterminer la concentration de cannabinoïdes dans un clone. Par exemple, 152 clone, un Delta 9-THC-souche contenant, et 87 clone, un CDB-souche contenant, ont tous deux été d'avoir de faibles concentrations de cannabinoïdes de 79 clone, qui est également une souche de la CDB contenant.Bien que les concentrations de cannabinoïdes diffèrent quantitativement parmi les clones, une tendance à la diminution de la concentration au cours du développement a été trouvé dans chacun des clones. En revanche, les tendances pour les concentrations de cannabinoïdes dans bractées en développement étaient différentes pour chacun des clones (Turner et al., 1981). En comparant les concentrations de cannabinoïdes avec des densités de la glande dans ces clones, il était évident que pour les feuilles végétatives, ainsi que les bractées pistil, on n'observe aucune corrélation positive entre tout type et toute personne glande cannabinoïdes caractéristique.

trichomes non glandulaires, rapporté aux cannabinoïdes absence (Malingre, et al., 1975), ont été trouvés à diminution de la densité à un taux uniforme au cours de l'ontogenèse des feuilles. Ce taux de diminution a été plus lent que le taux d'augmentation de la surface foliaire indiquant trichomes non glandulaire ont été continuellement lancé au cours du développement. Cependant, moins de trichomes non glandulaire ont été formées à chaque stade de développement de trichomes glandulaires.

Une comparaison du total des glandes capitatum-sessiles par feuillet avec des cannabinoïdes total par notice sur chacun des clones ont indiqué une corrélation positive que les deux paramètres ont été trouvés à augmenter pendant toute l'ontogenèse de la feuille. Une corrélation positive semblable pour ces paramètres a également été constatée pour les bractées pistillées (Turner et al., 1981). En outre, que l'on trouve pour les bractées, l'augmentation de ces deux paramètres indiquent que l'initiation de trichonies glandulaires et de la synthèse des cannabinoïdes se produit pendant toute l'ontogenèse de la feuille.

Bien que ces clones sont semblables et ont montré une augmentation du total des glandes capitatum-sessiles par feuille et des cannabinoïdes total par feuille que la feuille développée, le nombre des glandes et des niveaux de cannabinoïdes généralement différente d'un clone à.nombre glande totale par dépliant a montré la plus grande variabilité entre les clones au stade le plus mature de développement de la feuille. Cependant, tandis que les clones 79 et 87 (deux teneur élevée en CBD) ont été relativement similaires en nombre glande jusqu'à l'étape la plus mature, 152 clone (riche en A)-THC) ont moins de glandes à presque chaque étape de développement. Que ce soit en raison de facteurs génétiques ou environnementaux reste à déterminer. Les montants totaux des cannabinoïdes par tract étaient généralement comparables entre les clones au cours du développement foliaire, bien clone 79 ans avaient des niveaux plus élevés au stade foliaire intermédiaires.

Comme l'a montré pour les glandes capitatum sur les bractées (Turner et al., 1981), les cannabinoïdes totale détectée par foliole peut être divisé par le nombre total de capitatum-
glandes sessiles présente par feuillet de fournir un montant estimatif de cannabinoïdes par glande unique. Cette estimation a été faite pour tous les stades de développement pour chaque clone.Quand ce fut fait pour les feuilles végétatives, la teneur estimée en cannabinoïdes par glande individuels (45 ng pour 152 clone, 47 ng pour 79 clone, et
88 à 87 ng clone) a été supérieure à la teneur en cannabinoïdes trouve pour analysées précédemment glandes personne (Turner et al., 197 . Cette conclusion diffère considérablement de ce qui a été trouvé pour la bractée (Turner et al., 1981). Le bractées pistillées, on a estimé que la population glande pourrait contenir la quasi-totalité des cannabinoïdes détecté dans une bractée. Toutefois, pour les feuilles végétatives, il semble que les glandes ne contiennent qu'une partie de la cannabinolds détecté dans les feuilles, et, par conséquent, d'autres tissus de la feuille peuvent être impliquées dans la synthèse ou l'accumulation des cannabinoïdes.

En conclusion, cette étude a révélé plusieurs aspects de l'interdépendance des glandes et des cannabinoïdes sur le cannabis. Sur les feuilles végétatives, comme sur les bractées pistillées, des glandes et des cannabinoïdes sont produites tout au long du développement des organes, mais à des taux différents pour les feuilles par rapport à la bractée. trichomes non-glandulaires sont également mis en permanence au cours de l'ontogenèse d'organes. Une corrélation positive, comme cela a été trouvée pour les bractées, existe entre le nombre total des glandes et des cannabinoïdes total par foliole. Cependant, bien que les glandes sur la bractée semble en mesure de contenir la quasi-totalité de la teneur en cannabinoïdes des bractées, les glandes sur les feuilles contiennent apparemment une partie seulement des cannabinoïdes détecté dans les feuilles. Il semble probable que les cannabinoïdes sont présents dans d'autres tissus de la feuille. D'autres expériences sont en cours pour déterminer le site spécifique de la synthèse des cannabinoïdes dans la plante.


Bibliographie

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