La micropropagation
Bonjour,
Je vais tenter de vous expliquer de la manière la plus simple possible cette technique extraordinaire. Cette idée m'a été donné par Jahroide et ses questions sur la micropropagation .
Problématiques:
A quoi sert la micropropagation?
Elle sert à régénérer des plantes entières à partir de n'importe qu'elle partie de cette dernière.
De qu'elle partie se sert-on?
De toute, une feuille, un bourgeon, une racine, une cellule.
Cela parait trop beau, ou est l'arnaque?
Il n'y en a pas, cette technique est utilisé dans les laboratoires de recherche, et depuis peu dans les grandes exploitation, permettant de multiplier à l'infini une plante avec des caractères spéciaux.
Si d'autres questions vous viennent à l'esprit, n'hésiter pas.
Maintenant, la technique à proprement parler, et la vérification scientifique, par la suite je rajouterai comment le faire simplement à moindre coût et sans aucune connaissance.
Introduction
Outre l'utilisation récréative du cannabis, d'autres comme la production de fibre, de graine à alimentation humaine ou encore de production de molécules pharmaceutique existe.
Ce type d'application à fort coût économique ont très vite intéressé les chercheurs. Cependant le cannabis jouissant dune réputation défavorable très peu de publication sont accessible.
Néanmoins, pour moi la science devant être partagé et surtout pas gardé comme un secret, je vais vous révéler la technique la plus performante à l'heure actuel pour obtenir une quantité impressionnante de bouture dans un laps de temps fort court.
Matériels et méthodes
-Germination de graines à l'obscurité dans un milieu de 90% d'humidité pendant 24h.
-Stérilisation à l'hypochlorite de calcium 5% pendant 6-8-15 minutes.
-Puis remise en germination dans une solution aqueuse à 3% de glucose et 1% de saccharose.
-Suivit de la mise en croissance hors sol de plantes.
-Arrivé à 3 semaines de croissances les plantes sont sacrifiés.
-On part alors de pétiole, d'entre nœud, de bourgeons axilaires et du bourgeon apicale.
-Mise en culture dans boite d'Agar-agar présterilisé à l'autoclave, 120°C pendant 45 min.
-Puis les cultures sont placés à l'obscurité pendant 3 semaines, en présence d'une balance hormonale favorisant la différenciation des cellules en type racine. Cette enceinte est maintenu à 22°c.
-Puis passage en mode éclairage à 22°c, sous photo période de 16/8.
-Pour la formation des racines, plantules régénérées à 2 cm de haut ont été cultivés sur MS basal moyen complété avec 1,0 mg l-1 IAA (Auxine) et 1,0 mgl-1 NAA. Les plantes enracinées ont été transférés vers le sol et cultivées dans une serre.
Statistiques
Expériences impliquant quatre explants, cinq cultivars et une moyenne de huit combinaisons ont été réalisées dans une étude complete (RCB) de conception en trois répétitions.
L'effet des régulateurs de croissance des végétaux sur l'induction pour les différents explants (jeunes feuilles, pétioles,entrenœuds, bourgeons axillaires) a été exprimées en pourcentages. Pour savoir si les résultats étaient significatif nous avons utilisé Two-way ANOVA, et normalisé la distribution.
Résultats
La stérilisation des explants a été meilleur en remuant
la solution d'hypochlorite de calcium 5% pendant 15 min.
respectivement.
Toute les préparations ont puent être régénérés en entier, donnant naissance à des lignées génétiquement identiques mais phénotypiquement différentes. En effet partant de plantes dioïques strictes femelles nous sommes arrivé à des phénotypes hermaphrodites ou plutôt d'inter-sexes.
Ce phénomène à cependant été contrôlé conduisant à une restauration du phénotype femelle, partant de là une autre étude sera faite pour expliqué cette dédifférenciation ou comment partir de plantes hermaphrodites et induire une différentiation perpétuelle en un seule sexe de manière irréversible.
Discussion
Il faut préciser que les meilleures régénération ont été obtenu à partir de pétiole et de feuilles, de plus le bourgeon apicale à été régénéré aussi bien en présence que en absence d'hormone sa régénération sur milieu gélosé n'est donc pas obligatoire.
Partie 2 : Expérimentation facilité
Bonjour,
Aujourd'hui je vais tenter de vous expliquer comment faire de la micropropagation sans aucune connaissance. En revanche, il y à un peu de matériel à acheter, compter 50 euro pour réaliser 30 boîtes permettant chacune la micropropagation de 3 échantillons .
I-Introduction
Cette technique va permettre de régénérer une plante qu'elle que soit la partie prélevée, mais pour des soucis de technicités et de compétences, nous allons étudier le cas de la régénération par des cellules de parenchymes chlorophyllien de feuille (Pouvoir réducteur sous forme de NADPH(2)+ pour les curieux).
Outre l'aspect pratique de pouvoir préparer des milliers de boutures identiques au pied mère en partant de n'importe qu'elle partie de la plante, la micropropagation offre bien d'autres ouvertures plus que passionnantes et gorgés de surprises.
En conclusion je vous expliquerais comment croiser vos meilleur plante mère et les régénérer pour donner naissance à des plantes aux potentielles végétatifs et floristiques pratiquement infinie.
Je tiens également à dire que ces protocoles sont ma propriété intellectuel et qu'aucunes utilisations à but lucratif ou associatif ne peut avoir lieu sans ma permission sous risque de poursuites mais l'utilisation personnel est autorisé. Merci
II-Matériels et méthodes
Liste du matériels à ce procurer :
- Un scalpel végétal
- De l'alcool à 90%
- Une gazinière ou mieux un bec Bunsen
- Votre plante à micropropager
- Récipient pour micropropager ( boite de pétri, tube à essai, pot yaourt....)
- Une pipette précision 0.1ml
- Auxine 1mg/L
- Cytokinine 1mg/L
- Du milieu minérale MS ou Murashige ou Skoog
(Tout cela est facilement trouvable sur internet, en cas de problème je rajouterais les adresse ou en trouver)
Avrtissement :
- Les hormones ne supportent que très mal la température (elles sont thermolabiles), il est conseillé de les conserver au réfrigérateur à +/- 4°c. Et de ne les sortir que pour les expériences.
- Le milieu MS ou autres sont vendu en poudre, il faudra les compléter à l'eau et les faire chauffer au bain marie bouillant pour qu'ils se dissolvent, mais attention à bien le garder à cette température car une fois refroidit il durcit et est inutilisable.
- Toute les manipulations doivent se dérouler avec le plus de stérilité possible. Désinfecter le plan de travail, vos mains, tout le matériel, puis allumer votre bec Bensen (flamme blanche) et délimiter un rayon de 20 a 30 cm autour qui constituera votre cône de stérilité ou vous manipulerez.
Tout se passe dans le cône de stérilité
Préparation des milieux :
- Désinfecter vos boites à l'alcool, puis au bain marie à 80°c pendant 5 min, puis laissez sécher.
- Chauffer votre solution (milieu ms + eau jusqu'au col de la bouteille) au bain marie bouillant, pensez à laisser le bouchon ouvert. Une fois totalement dissout au bout de 30 à 60 minutes, laisser refroidir légèrement pendant 5 min puis couler dans vos boites sur environ 1 cm de profondeur. (conservation 3 semaines maximums)
- Minimum 2 boites par expérience, sur la première mettre 1mg/L d'auxine ( 0.5 ml)+ 1mg/L de cytokinine (0.5ml) nous permettra d'obtenir de Cals. Noté MSAC
Et sur la deuxième, mettre 0.1mg/l d'auxine (0.5ml) + 1mg/L de cytokinine (0.5ml), ne pas oublier de bien homogénéiser sur tout le substrat. Nous permettra de régénérer, noté MSEL
Prélèvement des fragments à micropropager :
- Prendre une feuille d'aluminium, la désinfecter au bain marie 80°c pendant 5 min, puis à l'alcool et la garder dans le champ stérile. Cette feuille permettra de stériliser le matériel végétal.
- Prendre une feuille de votre plante et la placer entre deux morceaux d'aluminium, laisser en contact 3 min, puis découper un carré de 1cm de coté, en prélevant une partie de la nervure centrale.
- Mettre les fragments sur les milieu, sceller les boites avec du scotch ou de la parafilm et placer les boîtes 3 semaines à 1 mois à température 18-20°c et faiblement de lumière.
III-Réultats
Les milieux MSEL vont développer des bourgeon, de là, rajouter de l'auxine et elles feront des racines, il ne reste plus qu'à les replanter en terre.
Les milieu MSAC vont former des amas de cellules indifférenciées et immortelles, en abaissant la température à 10°c vous pouvez les garder en quiscence pendant plusieurs années, et en prélever pour effectuer de la régénération sur milieu MSEL.
Il est donc facile de conserver des dizaines de génétiques dans sont frigo et de les régénérer au moment voulu. Cette technique permet la péréniter des variétés et un approvisionnement constant en bouture sélectionnées sur un phénotype intéressant afin de produire des boutures à l'infini.
IV-Discutions et évolutions
Le principe de la régénération peut également être utiliser pour réaliser des croisements, ceux-ci étant rendu impossible soit par le nombre de générations demander (10 ou 20 000), par le nombre de chromosomes inadéquates, par des notion de dominances récécivités, etc...
La solution se trouve dans la génération de protoplates (cellules végétal ayant perdu leurs paroi). Puis dans la fusion de deux protoplastes venant de plantes différentes. On obtient donc une cellules possédant les deux génomes et exprimant toutes les particularitées des deux plantes. Sans compter qu'elles sont donc au minimum tétraploïdes (voir beaucoup plus) et que du coup les stocks d'hormones de croissances et de floraisons sont doublés.
Il suffit donc de régénérer ces protoplastes fusionnés en micropropagation, et l'on obtient des plantes monstrueusement résistantes et productives, sans compter qu'elles peuvent être bouturées ou micropropager à l'infini.
Si cela intéresse du monde je ferais un tuto pour réussir sans connaissance la production et la fusion de protoplastes.
D'autres expériences sont également possibles mais on verra ça une prochain fois.
Cordialement Exo-plank#0
Petit complément :
Voici la technique mis en vidéo :
-Part I : ici
-Part II : ici
-Part III : ici
-Part IV : lien mort
-Part V : ici
-Part VI : ici
-Part VII : ici
-Part VIII : ici
-Part IX : lien mort
-Part X : ici
Voici la liste du matériel et la manière de procéder:
-ici
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Exemple de micropropagation réussi :
